ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 267—2025 乳突类圆线虫感染诊断技术 Diagnostic techniques for Strongyloides papillosus infection 2025 - 7 - 10发布 2025 - 7 - 10实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 267—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 中国兽医协会 团体标准技术委员会 兽医寄生虫 病防治分委 会提出。 本文件由中国兽医协会归口。 本文件起草单位： 南京农业大学、岳阳职业技术学院、江苏农林职业技术学院 。 本文件主要起草人： 严若峰、李祥瑞、徐立新、宋小凯、陆明敏、许永得、李泽华、卜永谦 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 267—2025 1 乳突类圆线虫感染诊断技术 1 范围 本文件规定了乳突类圆线虫感染 的临床、病原学和分子生物学 诊断技术。 本文件适用于牛羊等反刍动物乳突类圆线虫 感染的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 乳突类圆线虫病 strongyloidosis caused by Strongyloides papillosus 由乳突类圆线虫寄生于牛羊 等反刍动物小肠 黏膜内引起的以贫血、 消瘦、腹泻为主要临床症状的一 种寄生虫病。 3.2 乳突类圆线虫 感染 infection of Strongyloides papillosus 由乳突类圆线虫寄生于牛羊 等反刍动物小肠 黏膜内但不表现出临床症状的一种寄生虫感染。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（ base pair） DNA：脱氧核糖核酸（ deoxyribonucleic acid ） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（ deoxyribonucleoside triphosphate ） EB：溴化乙锭（ ethidium bromide ） EDTA：乙二胺四乙酸（ ethylene diamine tetraacetic acid ） PCR：聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction ） TAE：三羟甲基氨基甲烷 -乙酸 -乙二胺四乙酸（ tris-acetate -EDTA） 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 267—2025 2 5 试剂、耗材和设备 5.1 试剂 卢氏碘液 、生理盐水 、饱和氯化钠溶液 、50×TAE缓冲液、1×TAE缓冲液、10 mg/mL 溴化乙锭 、1.0 % 琼脂糖凝胶 、6×加样缓冲液等 。本文件中所使用的试剂均为分析纯，水符合 GB/T 6682 的要求。试剂制 备或配置方法按照附录 A进行。 5.2 耗材 载玻片、盖玻片、平皿、PCR反应管、搪瓷盆、塑料盆、烧杯、试管、40目网筛、挑虫针、毛笔、 吸管等。 5.3 仪器 微量移液器 、离心机、培养箱、光学显微镜 、体视显微镜 、PCR仪、紫外分光光度计 、电泳仪等。 6 临床诊断 6.1 临床症状 6.1.1 轻度感染 临床症状不明显，幼畜生长发育迟缓。 6.1.2 感染初期 第三期幼虫穿过皮肤移行到肺 ，引起湿疹、咳嗽、呼吸困难。严重感染的动物可 因极度衰弱而死亡 。 6.1.3 成虫寄生阶段 动物常表现出贫血、消瘦、腹泻等症状。 6.2 流行特点 6.2.1 易感动物 牛羊等反刍动物，幼龄动物较成年动物易感 。 6.2.2 感染途径 第三期幼虫主要经皮肤感染，幼畜哺乳时也可通过母畜乳汁感染。 6.2.3 流行季节 夏季和雨季流行较普遍，圈舍清洁卫生不良且潮湿时易于流行。 6.3 结果判定 动物出现 6.1.3临床症状且符合 6.2.1流行特点，判为疑似乳突类圆线虫病。疑似病例 应使用病原学或 分子生物学诊断方法进一步诊断。 7 病原学诊断 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 267—2025 3 7.1 虫卵检查 7.1.1 粪便样品准备 样品采集应符合 NY/T 541 的要求。 取待检动物新鲜粪便 10 g，置于烧杯，加入 50 m L饱和氯化钠溶 液，混匀 ，用 40目筛过滤至另一烧杯中。将滤液分装到 2 ~ 3支试管中，液面略高于试管口但不溢出，将 盖玻片盖在试管口液面上 ，静置 15 min后取下盖玻片，放在载玻片上 ，显微镜下检查。 7.1.2 显微镜检查 用光学显微镜于 10× 10倍镜下检查盖玻片内 所有视野，观察是否有虫卵。乳突类圆线虫虫卵大小为 42 μm ~ 60 μm × 25 μm ~ 36 μm，椭圆形，灰白色，卵壳薄而透明，虫卵内含幼虫，幼虫盘曲折叠，形 似折叠刀。虫卵形态 见附录 B中图B.1和附录 C中图 C.1第7号图。 7.1.3 结果判定 7.1.3.1 疑似阳性 显微镜检查过程中观察到 1个及以上的虫卵，且虫卵形态结构符合 7.1.2的描述。判定为疑似阳性， 应使用 7.2或第8章规定的方法进一步诊断。 7.1.3.2 阴性 未观察到 虫卵，或观察到 虫卵但虫卵形态特点不符合 7.1.2的描述。 7.2 幼虫检查 7.2.1 幼虫孵化 样品采集应符合 NY/T 541 的要求。 取待检动物 新鲜粪便 20 g，塑成半球形，放在平皿中，加少许水 （如果粪便已很稀，不 用加水），盖上平皿盖，在 28 ℃温箱中培养 6 h。将粪汁吸至载玻片上，加盖玻 片，显微镜下检查。 7.2.2 显微镜检查 用光学显微镜在 10× 10倍镜下观察。发现具有运动能力的幼虫，滴加卢氏碘液使幼虫死亡，使用显 微镜测微尺测量幼虫大小 （测量方法见附录 D）并观察虫体形态结构特点。 乳突类圆线虫 第一期幼虫， 体壁透明，无鞘，长 200 μm ~ 400 μm，头部钝圆，口腔短，食道呈杆状、具有前后食道球、 食道长约 为体长的 1/4 ~ 1/5。第一期幼虫形态特点见附录 B中图B.2。 7.2.3 结果判定 7.2.3.1 阳性 发现符合 7.2.2所描述特点的幼虫。 7.2.3.2 阴性 未观察到幼虫，或观察到幼虫 但其形态特点不符合 7.2.2的描述。 7.3 成虫检查 7.3.1 成虫采集 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 267—2025 4 样品采集应符合 NY/T 541 的要求。成虫样品采集按以下操作步骤进行： a) 取待检动物小肠，将肠内容物倒入大 烧杯或其他容器中 ，肠黏膜用生理盐水清洗 并用载玻片刮 取黏膜； b) 肠黏膜刮取物、 冲洗物和肠内容物全部转移至搪瓷盆 或塑料盘中 ， 加入其体积 5倍以上的生理 盐水，用玻璃棒缓慢搅拌 2 min使充分混匀 ，静置 15 min ~ 20 min； c) 倾去上清液，如此反复操作，直至上层液体透明为止，最后弃去上层液体，保留沉淀物 ； d) 分批取少量 沉淀物到大培养皿的生理盐水中，先后在白色和黑色的背景下寻找虫体， 发现虫体 用毛笔蘸取或用吸管吸 出，进行形态观察 ； e) 如此反复，至所有沉淀物全部检查完毕。 7.3.2 显微镜检查 将虫体用生理盐水清洗干净， 转移至载玻片上，滴加生理盐水至覆盖整个虫体，加盖玻片。 用体视 显微镜在2× 10倍镜下进行形态观察。寄生性乳突类圆线虫雌虫呈毛发状，长 4.38 mm ~ 5.92 mm ，乳白 色，口腔小，食道长、柱状，阴门位于体中后 1/3交界处，尾短、近似圆锥形。成虫形态特点参见附录 B 中图B.3。 7.3.3 结果判定 7.3.3.1 阳性 发现虫体 且虫体形态符合 7.3.2描述的特点。 7.3.3.2 阴性 未发现虫体 ，或发现虫体但其形态特点不符合 7.3.2的描述。 8 分子生物学诊断 8.1 样本DNA提取 样品采集应符合 NY/T 541 的要求。 按照 DNA提取试剂盒说明书提取粪便样品或虫体样品 DNA，用 紫外分光光度计测量 DNA样品的吸光值 A260，样品 DNA浓度的计算见公式（1）。样品 DNA稀释至 200 ng/μL备用。 样品 DNA浓度 =50 µ g/mL × A 260 × 样品稀释倍数 ……………………… …………（ 1） 式中： A260——紫外分光光度计测量 的DNA样品的吸光值 。 8.2 引物 以类乳突类圆线虫 18S rDN