ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 249—2025 猪瘟病毒竞争磁微粒 CLIA抗体检测方法 Competitive magnetic particle based chemiluminescence immunoassay fordetecting antibodies against classical swine fever virus 2025 - 5 - 19发布 2025 - 5 - 19实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 249—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国兽医协会提出并归口。 本文件起草单位 ：天津测易生物科技有限公司 、沧州市动物疫病预防控制中心 、内蒙古自治区动物 疫病预防控制中心（内蒙古自治区兽药检验中心） 、辽宁省动物疫病预防控制中心 、天津市动物疫病预 防控制中心 、山东省动物疫病预防与控制中心（山东省人畜共患病流调监测中心） 、北京市动物疫病预 防控制中心 、黑龙江省动物疫病预防 与控制中心 、新疆维吾尔自治区动物 疫病预防控制中心（新疆维吾 尔自治区动物 检疫所）、新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站（兵团动物疫病预防控制中心、兵团兽药 饲料监察所、兵团畜禽繁育改良总站、兵团草原工作管理总站、兵团草原监理站） 、海南省动物疫病预 防控制中心 。 本文件主要起草人：陈锡俊、张承礼、孙伟珊、董建伟、赵秀英、李文钢、徐国栋、朱向东、王犇、 王镇、兰邹然、张月、薛瑞雪、孔祥华、徐晓菲、陈伟、梅力、殷雨晴、程汝佳、沈光年、王林、李树 博、兰德松、顾贵波、郭宇、萨茹拉、韩佳岐、刘然、云涛、张智杰、张加勇、张君、王新、郝晓芳、 古丽曼·木哈买提拜、彭叶龙、美热木古丽·巴依待拉提、居马别克·夏拉巴依、李舵、马晓艳、古丽 娜尔、关团、苏贵成、 刘洁琼，赵化芳 、迟安庆、林明梓、章瑶、王璟 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 249—2025 1 猪瘟病毒竞争磁微粒 CLIA抗体检测方法 1 范围 本文件描述了猪瘟病毒竞争磁微粒 CLIA 抗体检测方法。 本文件适用于猪血清中猪瘟病毒特异性抗体的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 35906 猪瘟抗体间接 ELISA检测方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AE: 吖啶酯（ Acridinium Ester ） CLIA：化学发光免疫分析法（ Chemiluminescence Immunoassay ） CSF: 猪瘟（ Classical swine fever ） CSFV: 猪瘟病毒（ Classical Swine Fever Virus ） ELISA：酶联免疫吸附试验（ Enzyme -Linked Immunosorbent Assay ） RLU: 相对光单位（ Relative Light Unit ） 5 技术原理 方法采用磁微粒化学发光 --竞争法原理进行检测。链霉亲和素磁微粒、生物素标记的抗原、 AE标记 的抗体和待检血清混合孵育，发生特异性免疫反应；加入化学发光底物，读取 RLU。依据样本 RLU 与 标准品 RLU的对比，判定结果。发光强度与猪瘟病毒抗体的含量成反比 。 6 试剂与耗材 6.1 20×浓缩洗液，按照附录 A中A.1配制。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 249—2025 2 6.2 校准品稀释液，按照 A.2配制。 6.3 磁微粒工作液，含有 偶联链霉亲和素的磁微粒 的溶液。按照 附录 B中B.1配制。 6.4 抗原工作 液，含有生物素标记的 CSFV重组蛋白的溶液 。按照 B.2配制。 6.5 AE抗体工作液， 含有吖啶酯标记的 CSFV单克隆抗体的溶液 。按照 B.3配制。 6.6 CSFV抗体校准品， 包括 6个工作校准品， 抗体含量分别为 3.125 U、12.5 U、50 U、200 U、800 U、 3200 U，其中抗体含量分别为 50 U 和800 U的工作校准品也用作产品校准品 1 ~ 2使用。按照附录 C 制备。 6.7 CSFV抗体质控品，包括 质控品 1 和质控品 2，质控品 1抗体含量 ≤ 20 U，质控品 2抗体含量范围 为140 U ~ 260 U，按照附录 D制备。 6.8 化学发光底物 。 6.9 1.5 mL尖底离心管。 6.10 2 mL尖底离心管。 6.11 反应杯。 6.12 试剂船。 6.13 一次性采血器。 7 仪器与设备 7.1 全自动化学发光免疫分析仪。 7.2 电子天平，最大 称量： Max = 220 g；最小称量： Min = 10 mg；显示分度值： d = 0.1 mg。 7.3 离心机，转速： 12000 r/min 。 7.4 可调单道移液器， 量程为 20 μL ~ 200 μL，100 μL ~ 1000 μL。 7.5 恒温培养箱。 8 检测前准备 8.1 样品采集与处理 样品采集按照 NY/T 541 进行。采集静脉血后，将血样室温下倾斜 30°静置 2 h ~ 4 h，待血液凝固有血 清析出时，无菌剥离凝血块，然后置 2 ℃冰箱过夜，待大部分血清析出后即可取出血清，必要时可低速 离心（ 1000 g离心 10 min ~ 15 min ）分离出血清。采集的血清样品在无法于 12 h内送检的情况下，应放 于- 20 ℃冻存。 血清样本运输时应注意 2 ℃ ~ 8 ℃冷藏。 样品检测前 3000 r/min离心 2 min，取上清放于 1.5 mL尖底离心管中，体积应大于 300 μL，待检；若 样品中存在沉淀或絮状物等杂质，应离心去除杂质，轻柔操作，避免出现泡沫。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 249—2025 3 8.2 溶液配制 洗涤液：将 20×浓缩洗液用去离子水或蒸馏水 1:20倍稀释，装入洗涤液桶。 去离子水或蒸馏水均应符合 GB/T 6682 的要求。 8.3 仪器准备 放置反应杯， 扫描二维码导入反应程序、标准曲线及校准品信息 ，放置底物和系统维护液 ，开始自 检。 9 操作步骤 9.1 装填试剂 将磁微粒工作液、抗体工作液、抗原工作液分别装入试剂船上对应试剂瓶中，磁微粒吹打混匀，试 剂船瓶盖换为胶盖；将试剂船装入试剂仓中。 9.2 装填样本 取待检样本于 1.5 mL/2 mL 离心管中（样本量需 300 μL以上），置于专用样品架，设置测试样品信 息，进行检测。 9.3 免疫反应 取 25 μL 待测样本， 20 μL 磁微粒工作液、 50 μL 抗体工作液、 50 μL抗原工作液，分别加入反 应杯中， 37 ℃孵育 15 min。 9.4 清洗 使用磁铁吸附磁微粒 30 s，使其聚集于管壁，弃去上清液。加入 1×洗涤液 300 μL 悬浮磁微粒，混 匀30 s后吸附磁微粒，弃去 1×洗涤液。重复清洗 3次。 9.5 检测 RLU 加入化学发光底物 100 μL 于清洗后的反应杯中，混匀 30 s 悬浮磁微粒，检测 RLU。 10 结果计算 10.1 标准曲线拟合 将CSFV抗体工作校准品 1 ~ 6放入样本架，按照 9 进行检测，检测完成后 。以工作校准品抗体含量 （3.125 U、12.5 U、50 U、200 U、800 U、3200 U）为横坐标、相应检测 RLU为纵坐标拟合四参数为标 准曲线，四参数公式为（ 1），当 R2≥ 0.99时，可以用于结果计算和判定。 Y=a-d 1+(x c)b+d………………………………………………… （1） 式中： a——当x趋近于负无穷时 Y的极限值； b——斜率因子 ； c——拐点参数； 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 249—2025 4 d——当x趋近于正无穷时 Y的极限值。 10.2 标准曲线校准 将CSFV抗体产品校准品 1和产品校准品 2放入样本架，按照仪器说明书对标准曲线进行校准。 以下情况应先校准再进行检测： a) 试剂成分发生改变； b) 同一批次试剂盒的使用周期超过 28 d； c) 根据具体需要：如质控结果不符合要求。 10.3 质控 需要时检测质控品，检测值在参考范围内方可继续样品