ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 246—2025 猪繁殖与呼吸综合征病毒间接磁微粒 CLIA抗体检测方法 Indirect magnetic particle based chemiluminescence immunoassay for detecting antibodies against porvine reproductive and respiratory syndrome virus 2025 - 5 - 19发布 2025 - 5 - 19实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 246—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国兽医协会提出并归口。 本文件起草单位：兰州兽研生物科技有限公司、中国农业科学院兰州兽医研究所、新疆维吾尔自治 区动物疾病预防控制中心、第八师动物疫病预防控制中心、石家庄市动物疫病预防控制中心 、湖南省动 物疫病预防控制中心。 本文件主要起草人： 林密、包艳芳、左宜理、刘亚涛、窦立静、蒋韬、李涛善、许亚改、杨光、潘 晓乐、马伟、陈强斌、苏晓慧、赵艳梅、刘强、杜义明 、范仲鑫、唐小明 、许辉。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 246—2025 1 猪繁殖与呼吸综合征病毒间接磁微粒 CLIA抗体检测方法 1 范围 本文件描述了 猪繁殖与呼吸综合征 病毒间接磁微粒 CLIA抗体检测方法。 本文件适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗体检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本 文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18090 猪繁殖与呼吸综合征 诊断方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件 CLIA: 化学发光免疫分析法（ Chemiluminescence Immunoassay ） ELISA：酶联免疫吸附 试验（Enzyme -Linked Immunosorbent Assay ） RLU：相对发光值（ Relative Light Unit，RLU） 5 试剂 5.1 25×浓缩洗液，按照附录 A中的 A.1配制。 5.2 磁微粒工作液（偶联猪繁殖与呼吸综合征病毒 N蛋白的磁微粒悬浮液）。 5.3 体系稀释液，按照 A.2配制。 5.4 酶标抗体 工作液（碱性磷酸酶标记兔抗猪 IgG）。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 246—2025 2 5.5 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体工作校准品：包括工作校准品 1、工作校准品 2、工作校准品 3、工 作校准品 4、工作校准品 5、工作校准品 6，抗体含量分别为 0 U、6.25 U、25U、100 U、400 U、800 U， 按照附录 B制备。 5.6 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体质控品：质控品 1抗体含量＜ 20U，质控品 2抗体含量为 70 U ~ 180 U，按照附录 C制备。 5.7 化学发光底物。 6 仪器设备及耗材 本方法应准备仪器设备及耗材如下： —— 全自动化学发 光免疫分析仪：磁微粒酶促化学发光检测设备； —— 电子天平：最大称量： Max=220 g；最小称量： Min=10 mg；显示分度值： d=0.1 mg； —— 离心机：最高转速： 16000 r/min； —— 可调单道移液器（ 10 μL ~ 100 μL、100 μL ~ 1000 μL）； —— 1.5 mL/2 mL离心管； —— 反应杯； —— 试剂船。 7 技术原理 本方法以磁微粒作为固相载体，在反应过程中形成磁微粒 -抗原 -抗体复合物，利用酶促化学发光作 为免疫学反应的信号放大系统，读取发光值（ RLU），通过四参数公式拟合的校准曲线计算 猪繁殖与呼 吸综合征病毒 的抗体浓度。 8 检测前准备 8.1 样品采集及 处理 样品采集按照 NY/T 541 的规定进行。无菌静脉采血，不少于 2 mL，用自然析出法分离血清后，置 于无菌血清管中，若在一周内检测，可置 2 ℃ ~ 8 ℃ 条件下保存，若一周内无法完成检测，应置于 -20 ℃ 以下保存。血清样本运输时应注意 2 ℃ ~ 8 ℃ 冷藏。 若样品中存在沉淀或絮状物等杂质，需 8 000 r/min ，离心 2 min后再进行检测 。 8.2 溶液配制 8.2.1 洗液：将 25×浓缩洗液用无离子水或蒸馏水 1:25倍稀释，装入洗液桶。 8.2.2 无离子水或蒸馏水均应符合 GB/T 6682 的要求。 8.3 仪器准备 按全自动化学发光免疫分析仪器要求进行仪器准备。 8.4 试剂准备 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 246—2025 3 将偶联磁微粒工作液、酶标抗体 工作液、体系稀释液分别装入试剂船上对应试剂瓶中，将磁微粒吹 打混匀，试剂船瓶盖换为胶盖；将试剂船装入试剂仓中。 9 操作步骤 9.1 检测步骤 9.1.1 取样品（工作校准品、质控品、待检样本）于 1.5 mL/2 mL 离心管中，置于专用样品架，设置测 试样品信息，进行检测。 9.1.2 免疫反应：取 10 μL待测样本， 25 μL磁微粒工作液、 60 μL体系稀释液，分别加入反应杯中， 37 ℃ 孵育 5 min； 9.1.3 清洗：使用磁铁吸附磁微粒 30 s，使其聚集于管壁，弃去上清液。加入洗液 300 L悬浮磁微粒， 混匀 30 s后吸附磁微粒，弃去洗液。重复清洗 4次。 9.1.4 酶反应：取 100 μL酶标抗体工作液加入反应杯中， 37 ℃孵育 10 min； 9.1.5 清洗：同步骤 9.1.3 9.1.6 检测：加入化学发光底物 100 L于清洗后的反应杯中，混匀 30 s 悬浮磁微粒， 37℃反应 3 min， 检测发光值（ RLU）。 9.1.7 计算：将发光值（ RLU）代入校准曲线，计算样本中的抗体含量。 9.2 质控 按9.1检测质控 品，检测值在参考范围内，方可继续检测。 如下情况应检测质控品： a） 试剂成分发生改变或校准曲线校准后； b) 质控品超过 24 h需检测 1次。 9.3 校准曲线拟合 按9.1检测工作校准品 1 ~ 工作校准品 6，以工作校准品抗体含量（ 0 U、6.25 U、25 U、100 U、400 U、800 U）为横坐标、相应检测发光值为纵坐标拟合四参数为校准曲线，四参数按公式计算。 （Y=(a -d)/[1+(x/c)*b]+d ，其中： a表示反应的最大值； b表示曲线的斜率； c表示半效浓度； d表示反应 的本底。） 校准曲线见附录 D。 9.4 结果计算 检测完成后， 将待检样品检测发光值代入校准曲线， 计算结果即为待检样本中猪繁殖与呼吸综合征 病毒抗体含量。 10 结果判定 10.1 质控品参考范围 质控品 1抗体含量＜ 20 U，质控品 2抗体含量为 70 U ~ 180 U ，实验结果成立 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 246—2025 4 10.2 判定依据 若抗体含量 ≥66 U时，判为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性；若抗体含量＜ 66 U时，判为猪繁 殖与呼吸综合征病毒抗体阴性。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台