ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 245—2025 小反刍兽疫病毒间接磁微粒 CLIA抗体 检测方法 Indirect magnetic particle based chemiluminescence immunoassay for detecting antibodies against peste des petits ruminants virus 2025 - 5 - 19发布 2025 - 5 - 19实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 245—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 中国兽医协会提出并归口。 本文件起草单位 ：兰州兽研生物科技有限公司、中国农业科学院兰州兽医研究所、内蒙古自治区动 物疫病预防控制中心、宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心 。 本文件主要起草人 ：林密、蒙学莲、包艳芳、李峰松、蒋韬、孙跃峰、李涛善、许福玲、朱学亮、 王建龙、李知新、潘晓乐、特木尔巴根、郭宇、王玉梅、周海宁 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 245—2025 1 小反刍兽疫病毒间接磁微粒 CLIA抗体检测方法 1 范围 本文件描述了小反刍兽疫病毒 间接磁微粒 CLIA抗体检测方法。 本文件适用于小反刍兽疫病毒 抗体检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27982 小反刍兽疫竞争 ELISA方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CLIA：化学发光免疫分析法（ chemiluminescence immunoassay ） ELISA：酶联免疫吸附 试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay ） RLU：相对发光值（ relative light unit，RLU） 5 技术原理 本方法以磁微粒作为固相载体，在反应过程中形成磁微粒 -抗原 -抗体复合物，利用酶促化学发光作 为免疫学反应的信号放大系统，读取发光值（ RLU） ，通过四参数公式拟合的校准曲线计算小反刍兽疫 病毒 N蛋白的抗体浓度。 6 试剂 6.1 25×浓缩洗液，按照附录 A中的 A.1配制。 6.2 磁微粒工作液（ 偶联小反刍兽疫病毒 N蛋白的磁性微粒）。 6.3 稀释液，按照 A.2配制。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 245—2025 2 6.4 酶标抗体工作液 （碱性磷酸酶标记 兔抗羊 IgG）。 6.5 小反刍兽疫病毒抗体工作校准 品：包括工作校准品 1、工作校准品 2、工作校准品 3、工作校准品 4、工作校准品 5、工作校准品 6，抗体含量分别为 0 U、12.5 U、50 U、200 U、800 U、3200 U，按照 附录 B制备。 6.6 小反刍兽疫病毒 抗体质控品： 质控品 1抗体含量≤ 20 U，质控品 2抗体含量范围为 160 U～240 U， 按照附录 C制备。 6.7 化学发光底物 。 7 仪器设备及耗材 本方法应准备仪器设备及耗材如下： —— 全自动化学发 光免疫分析仪：磁微粒酶促化学发光检测设备； —— 电子天平：最大称量： Max=220 g；最小称量： Min=10 mg；显示分度值： d=0.1 mg； —— 离心机：最高转速： 16000 r/min； —— 可调单道移液器（ 10 μL ~ 100 μL、100 μL ~ 1000 μL）； —— 1.5 mL/2 mL离心管； —— 反应杯； —— 试剂船。 8 检测前准备 8.1 样品采集 及处理 样品采集按照 NY/T 541 的规定进行。无菌注射器静脉采血，不少于 2 mL，用自然析出法分离血清 后，置于无菌血清管中，若在一周内检测，可置 2 ℃ ~ 8 ℃条件下保存，若超过一周检测，应置于 -20 ℃ 以下保存。血清样本运输时应注意 2 ℃ ~ 8 ℃冷藏。 注：若样品中存在沉淀或絮状物等杂质，需 8000 r/min ，离心 2 min后再进行检测。 8.2 溶液配制 8.2.1 洗液：将 25×浓缩洗液用无离子水或蒸馏水 1:25倍稀释，装入洗液桶。 8.2.2 无离子水或蒸馏水均应符合 GB/T 6682 的要求。 8.3 仪器准备 按全自动化学发光免疫分析仪器要求进行仪器准备。 8.4 试剂准备 将偶联磁微粒工作液 、酶标抗体工作液 、稀释液分别装入试剂船上对应试剂瓶中，将磁微粒吹打混 匀、试剂船瓶盖换为胶盖；将试剂船装入试剂仓中。 9 操作步骤 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 245—2025 3 9.1 检测步骤 9.1.1 取样：取样品（工作校准品、质控品、待检样本）于 1.5 mL/2 mL 离心管中，置于专用样品架， 设置测试样品信息，进行检测。 9.1.2 免疫反应：取 20 μL待测样本、 25 μL磁微粒工作液、 55 μL稀释液，分别加入反应杯中， 37 ℃ 孵育 10 min； 9.1.3 清洗：使用磁铁吸附磁微粒 30 s，使其聚集于管壁，弃去上清液。加入洗液 300 L悬浮磁微粒， 混匀 30 s后吸附磁微粒，弃去洗液，重复清洗 4次； 9.1.4 酶反应：取 100 μL酶标抗体工作液加入反应杯中， 37 ℃ 孵育 10 min； 9.1.5 清洗：同步骤 9.1.3； 9.1.6 检测： 加入化学发光底物 100 L于清洗后的反应杯中， 混匀 30 s 悬浮磁微粒， 37℃反应 3 min， 检测发光值（ RLU）。 9.1.7 计算：将发光值（ RLU）代入校准曲线，计算样本中的抗体含量。 9.2 质控 按9.1步骤检测质控品，检测值须在参考范围内，方可继续检测。如出现以下情况，应重新检测质 控品： a）试剂成分发生改变或校准曲线校准后； b）质控样品超过 24 h内需检测 1次。 9.3 校准曲线拟合 按9.1检测工作校准品 1至工作校准品 6，以工作校准品抗体含量（ 0 U、12.5 U、50 U、200 U、800 U、 3200 U）为横坐标、相应检测发光值为纵坐标拟合四参数为校准曲线，四参数按公式计算。 （Y=(a -d)/[1+(x/c)*b]+d ，其中： a表示反应的最大值； b表示曲线的斜率； c表示半效浓度； d表示反应 的本底。 ） 校准曲线见附录 D。 9.4 结果计算 检测完成后， 将待检样品检测发光值代入校准曲线， 计算结果即为待检样本中小反刍兽疫病毒抗体 含量。 10 结果判定 10.1 质控血清参考范围 质控品 1抗体含量 ≤20 U，质控品 2抗体含量为 160 U ~ 240 U，实验结果成立 。 10.2 判定依据 若抗体含量 ≥90 U判为小反刍兽疫病毒抗体阳性；抗体含量＜ 90 U判为小反刍兽疫病毒抗体阴性。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 245—2025 4 附 录 A （规范性） 试剂的配制 A.1 25×浓缩洗液 配制 将表 A.1中的试剂依次加入烧杯中 ，加灭菌蒸馏水至 600 mL，溶解，定容至 1 000 mL ，置于 2 ℃ ~ 8 ℃保存备用。 表A.1 25 ×浓缩洗液配方 名称 称量 丁二酸 1.98 g 六水丁二酸钠 62.16 g 氯化钠 225.00 g 吐温 -20 13.75 g A.2 稀释液配制 将表 A.2中的试剂依次加入烧杯中，加灭菌蒸馏水至 600 mL，溶解，定容至 1 000 mL ，置于 2 ℃ ~ 8 ℃保存备用。 表A.2 稀释液配方 名称 称量 磷酸氢二钠 1.15 g 氯化钠 8.00 g 磷酸二氢钠 0.20 g 吐温 -20 0.50 mL A.3 校准品稀释液配制 将表A.3中的试剂依次加入烧杯中，加灭菌蒸馏水至 600 mL，溶解，定容至 1000 mL，置于 2 ℃ ~ 8 ℃保存备用。 表A.3 校准品稀释液配方 名称 称量 磷酸氢二钠 1.15 g 氯化钠 8.00 g 磷酸二氢钠 0.20 g 牛血清白蛋白 1.00 g 海藻糖 5.00 g 吐温 -20 0.50 mL 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台