ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 244—2025 口蹄疫O型、非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼 吸综合征病毒抗体联检胶体金免疫层析 检测方法 Colloidal gold immunochromatographic assay for detection of antibodies against FMDV type O 、ASFV、CSFV、PRRSV 2025 - 5 - 19发布 2025 - 5 - 19实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 244—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本标准涉及专利 。 本标准由兰州兽研生物科技有限公司提出。 本标准由中国兽医协会归口。 本标准起草单位： 兰州兽研生物科技有限公司、中国农业科学院兰州兽医研究所、青海省动物疫病 预防控制中心、河北省动物疫病预防控制中心、隆回县动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：蒋韬 、林密、孙燕燕、闫丽欢、 张海霞、李昕、杨光、贺华丽、李涛善、包艳 芳、郭建宏、何继军、杨吉飞、张立成、王谢忠、李翀、魏泽华、张腾帅、周早花。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 244—2025 II 引 言 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时， 可能涉及到条目 5、7、8、9、10、11、附录 A 和附录 B相关的专利的使用 。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。 该专利持有人已向本文件的发布机构承诺，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件 下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以 下联系方式获得： 专利持有人姓名：兰州兽研生物科技有限公司 地址：甘肃省兰州市城关区盐场堡徐家坪 1号 请注意除上述专利外， 本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责 任。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 244—2025 1 口蹄疫O型、非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体联检 胶体金免疫层析检测方法 1 范围 本文件描述了口蹄疫 O型、非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体联检胶体金免疫层析检 测方法。 本文件适用于猪血清中口蹄疫病毒 O型抗体、非洲猪瘟病毒抗体、猪瘟病毒抗体、猪繁殖与呼吸综 合征病毒抗体快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 胶体金免疫层析技术 Colloidal gold immunochromatograph y assay；GICA 以胶体金作为示踪物， 将抗原抗体固定在硝酸纤维素膜上，通过层析来呈现免疫反应结果的一种 免 疫标记技术 。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ASFV：非洲猪瘟病毒（ African Swine Fever Virus ） CSFV：猪瘟病毒（ Swine fever virus ） FMDV：口蹄疫病毒（ Foot-and-Mouth Disease Virus） PEG 6000 ：聚乙二醇 6000（Polyethylene Glycol 6000 ） PRRSV：猪繁殖与呼吸综合征病毒（ Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus ） SDS-PAGE：十二烷基磺酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳（ Sodium Ddodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis ） 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 244—2025 2 5 技术原理 采用胶体金免疫层析技术，检测 口蹄疫 O型病毒、非洲猪瘟 病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征 病毒抗体。 通过样本与免疫胶体金标记物沿层析膜移动， 样本中目标 抗体分别与四种免疫胶体金标记物、 检测线（ T线）上的抗原结合而显色，免疫胶体金标记物继续移动与质控线（ C线）上的抗体结合显色。 若某病毒对应的 观测窗里的 C线与 T线均显色，则该 待测样本含有对应病毒抗体；若某病毒对应的 观测 窗里的 C线显色且 T线不显色，则该 待测样本不含有对应病毒抗体。 6 试剂与耗材 6.1 口蹄疫 O型病毒纯化抗原 146S，见附录 A的A.1。 6.2 非洲猪瘟病毒重组 p30蛋白，见A.2。 6.3 猪瘟病毒重组 E2蛋白，见 A.3。 6.4 猪繁殖与呼吸综合征病毒 N蛋白，见A.4。 6.5 口蹄疫、非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体联检胶体金免疫层析试纸条， 见附录 B。 6.6 相关试剂配制 ，见附录 C。 7 器材 7.1 三维划膜喷金仪 。 7.2 数控高速斩切机 。 7.3 隔水式恒温培养箱 。 7.4 磁力搅拌器 。 7.5 可调单道移液器 （10 μL ~ 100 μL、100 μL ~ 1000 μL）。 8 样品采集及保存 8.1 样品采集 按照 NY/T 541规定进行样品的采集和处理。无菌注射器静脉采血，不少于 2 mL，用自然析出法分 离血清后，置于无菌血清管中。血清清亮，无溶血，无污染。 8.2 血清样品的保存与运输 按照 NY/T 541 规定进行血清样品的存放与运输。血清样品置 2 ℃ ~ 8 ℃ 条件下保存。若超过一周 检测，置于 - 20 ℃以下冷冻保存。 9 操作步骤 9.1 取检测卡 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 244—2025 3 将试剂盒从 2 ℃ ~ 8 ℃取出，平衡 10 min，拆除铝箔袋，将 试纸卡平放在桌面上。 9.2 加样及孵育 用移液器吸取血清样本 ，向各样品孔中 加入 30 μL，之后再分别向 样品孔中 各滴加 30 μL扩展液。 结果将在10 min内出现在观测框。 10 试验成立条件 试纸卡 C线显色，试验成立，结果有效； C线不显色 ，试验不成立，结果无效。 11 结果判定 观察各观测窗内 T线色带有无，按照如下标准分别进行判定。被检血清样品 C线与 T线均出现清 晰可见红色条带， 判定为阳性； 被检血清样品仅 C线出现清晰可见红色条带， T线不显色， 判定为阴性。 如图 1。 图1 本联检试纸卡各观测窗检测结果示意 图 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 244—2025 4 附 录 A （资料性） 抗原制备 A.1 口蹄疫O型病毒纯化抗原 146S制备 A.1.1 毒种的繁殖与灭活 将O/MYA98/JSCJ/2010 细胞毒种， 按维持液 5 % ~ 10 %的量接种 至生长良好的 BHK -21单层细胞， 于37 ℃培养 8 h ~ 12 h。当达到 90 %以上细胞病变时，用 7.5 % NaHCO3 溶液调 pH至7.6 ~ 7.8，加入 青霉素（ 100 IU/mL ）、链霉素（ 100 IU/mL ），用 2 mmol/L 二乙烯亚胺在 30℃下灭活 24 h，加入 2% 硫代硫酸钠阻断 。2 ℃ ~ 8 ℃ 4000 r /min离心 30 min，取上清 即为 O/MYA98/JSCJ/2010 灭活制苗病毒抗 原液。-20 ℃冻存。 A.1.2 抗原的去脂与浓缩 将-20 ℃保存的 O/MYA98/JSCJ/2010 制苗灭活病毒抗原解冻， 按 80 g/L加入 PEG 6000 和40 g/L加 入NaCl，充分搅拌 4 h，2 ℃ ~ 8 ℃过夜；后 8000 r /min离心 45 min，弃上清；用 PB缓冲液悬浮沉淀 （冰上操作），匀浆器反复研磨，至终体积 100 mL；加入 2倍体积的三氯乙烯于密闭容器中，剧烈振 荡充分乳化，后在 2 ℃ ~ 8 ℃ 8000 r /min离心 30 min，收集上层液；继续 2 ℃ ~ 8 ℃、45000 r /min离心 3 h，弃上清； PB缓冲液悬浮沉淀，匀浆器中研磨，至终体积 6 mL；加入 1 %的脱氧胆酸钠溶液，充分 摇匀， 2 ℃ ~ 8 ℃过夜，即为浓缩病毒抗原。 A.1.3 蔗糖密度梯度离心 配制 45 %、35 %、25 %、15 %四种浓度梯度蔗糖溶液；在离心管中先加入 45 %蔗糖溶液 2.5 mL， 再依次叠加 35 %、25 %、15 %蔗糖溶液 2.5 mL，制备 6个蔗