ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 241 —2025 爬行动物血细胞人工计数操作规程 Manual procedure for counting blood cells in reptiles 2025 - 5 - 19发布 2025 - 5 - 19实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 241—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 北京中农大动物医院有限公司 提出。 本文件由中国兽医协会归口。 本文件起草单位： 北京中农大动物医院有限公司、中国农业大学、北京农业职业学院。 本文件主要起草人： 张雪芳、林嘉宝、刘洋、马文、吕艳丽、夏兆飞 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 241—2025 1 爬行动物血细胞人工计数操作规程 1 范围 本文件规定了爬行动物各类血细胞识别、人工计数、血细胞比容测定等血液常规指标的检测方法。 本文件适用于爬行动物血液学分析。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 红细胞比容 packed cell volume ；PCV 红细胞占全血容量的百分比。 3.2 红细胞平均体积 mean corpuscular volume；MCV 单个红细胞的平均体积 。 3.3 红细胞平均血红蛋白浓度 mean corpuscular hemoglobin concentration ；MCHC 每升红细胞中所含血红蛋白克数 。 3.4 红细胞平均血红蛋白量 mean corpuscular hemoglobin ；MCH 每个红细胞内所含血红蛋白的平均量。 4 爬行动物血细胞组成 爬行动物血细胞组成如下： ——红细胞； ——白细胞：异嗜性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞（包括嗜苯胺蓝 细胞）； ——凝血细胞。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 241—2025 2 5 爬行动物血液常规指标 爬行动物血液常规指标包括： ——细胞数量：红细胞计数 （RBC）、白细胞计数 （WBC）、凝血细胞计数 （Thr）； ——白细胞分类计数（各类白细胞所占百分比和绝对值）； ——血红蛋白 (HB)； ——红细胞平均体积（ MCV）、红细胞平均血红蛋白浓度 （ MCHC）、红细胞平均血红蛋白量 （ MCH）。 6 准备 6.1 器材和试剂 6.1.1 器材 显微镜、 毛细血管离心机及读卡器、 高速离心机、 分光光度计、 移液器 （ 20 μL、100 μL 、1 000 μL）、 血液混匀仪、 Neubauer 血细胞计数板和血盖片、带盖的培养皿、滤纸、 5 mL离心管、棉棒、载玻片、盖 玻片、比色皿、擦镜纸、毛细离心管、黏土。 6.1.2 试剂 Natt-Herrick’s 溶液（可购买或配制，配制方法详见附录 A）、 Drabkin试剂、瑞氏 -吉姆萨染色液、 肝素锂抗凝采血管或 EDTA抗凝采血管、蒸馏水。 6.2 标本准备 6.2.1 抗凝剂的选择 抗凝剂的选择如下： ——根据物种和品种选择不同的抗凝剂； ——常用肝素锂和 EDTA，若 EDTA可能会导致部分爬行动物溶血时，宜选择肝素锂； ——用肝素锂抗凝的爬行动物血液制作血涂片，染色后可能整个背景偏蓝色，且白细胞和凝血细胞 有聚集现象。 示例：角鳖（ Apalone spinifera）EDTA抗凝血溶血，缅甸蟒（ Burmese Python ）EDTA和肝素抗凝血没有溶血区别， 绿鬣蜥 (Green iguana )EDTA抗凝血无溶血反应。 6.2.2 血液标本 血液标本的制备应注意以下事项： ——通常用血量 0.5 mL ~ 1 mL，健康动物血液总量约占体重 4 % ~ 6 %，采集不超 10 %的血液总 量是安全的； ——血液标本应无淋巴液污染，若有淋巴液污染应弃用并重新采集； ——疾病状态下血液量根据动物身体状态灵活选择； ——应采集后用新鲜血液立即制作血涂片； ——如果不能立即对抗凝全血进行检测，应将血保存在 4 ℃，并在采集后的 24 h内进行检测。 7 红细胞计数 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 241—2025 3 红细胞计数按以下步骤操作： a) 取4 mL Natt -Herrick’s 溶液到 5 mL离心管中； b) 吸取 20 μL混匀抗凝全血， 擦拭吸头尖端的外部，将全血打入 Natt-Herrick’s 溶液中； c) 孵育 15 min ~ 30 min ； d) 使用血液混匀器或手动轻轻上下翻转将液体混匀； e) 使用干净、干燥的血细胞计数板，固定血盖片，用移液器吸取少量混匀液放入血细胞计数板， 避免气泡进入； f) 将滤纸放在培养皿中，用蒸馏水轻轻润湿滤纸； g) 将棉拭子头掰掉，将 2根棉棒棍，放在带盖培养皿的底部； h) 装载血的血细胞计数板架在棉棒棍上，盖上培养皿避免脱水 ； i) 等待 5 min，细胞沉淀； j) 显微镜（ 400 ×）计数：计数中央大方格的四角和正中共 5个中方格（含 80个小方格）内的红 细胞。计数时，若红细胞压在方格边线上，计上不计下、计左不计右。若各中方格内红细胞数 相差超过均值的 ± 10%，宜重做。对观察到的白细胞不计入。 k) 计算：红细胞计数 （RBC）用一个保留两位小数的数值 × 1012/L表示，计算公式见公式（1）： RBC（/L）= N5WBC / 5 × 25 × 200 × 107 ……… …………… ………（1） 式中： N5RBC—— 5个中方格的红细胞总数； N5RBC/5×25——中央大方格内的红细胞总数； 200——稀释倍数 ； 107—— 0.1 μL和 L单位转换 。 8 红细胞比容（ PCV） 红细胞比容检测按以下步骤操作： a) 把毛细离心管一端放入混匀的抗凝全血中，使血液吸到毛细离心管的三分之二位置； b) 擦拭毛细离心管管壁； c) 毛细离心管一侧末端用黏土密封； d) 将密封好的毛细离心管放入离心机中，堵塞的一端朝外， 10 000 r/min 离心 5 min； e) 离心后的血在离心管中分为三层，上层为血浆，中间层为白细胞和凝血细胞，下层为红细胞； f) 使用读卡器测量：黏土一端对准读卡器的底端，血浆顶部对准读卡器最上方，位置刻度对准中 间淡黄层最下方，读数，用两位小数或百分比表示，如 0.42或42%。 9 红细胞平均体积（ MCV） MCV的计算见公式（2）： MCV （fL）= PCV / RBC × 1015 ……… …………… ………（2） 式中： PCV ——红细胞比容； RBC ——红细胞计数； 1015——fL和 L单位转换 。 10 红细胞比容（ PCV） 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 241—2025 4 血红蛋白测定用 氰化血红蛋白法，按以下步骤操作： a) 吸取 6 μL混匀全血和 600 μL Drabkin 试剂，混合均匀，室温下孵育至少 1 h； b) 将上述混合液放入离心机中； c) 10 000 r/min离心 10 min，使降解的蛋白质沉淀； d) 以纯 Drabkin试剂做空白，将分光光度计调零，用分光光度计在 540 nm处读取吸光度； e) 血红蛋白计算见 公式 （3）： Hb（g/L）= (A540‑ Ablank ) ×（WHB× DF）/（CE × d × 1000）……… …………… ………（3） 式中： A540——被测溶液在 540 nm处的吸光度； ABlank——空白液体（ Drabkin试剂）在 540 nm下的吸光度； WHB—— Hb四聚体的分子量（ 64 458）； DF——稀释系数（ 101）； CE——三聚氰甲烷血红蛋白在 540时的消光系数 nm（44）； d——以cm为单位的光路值（ 1）； 1 000 —— mg和g 单位转换。 11 红细胞平均血红蛋白浓度（ MCHC） MCHC的计算见公式（4）： MCH （g/L）= HB / PCV ……… …………… ………（4） 式中： HB——血红蛋白； PCV ——血细胞比容。 12 红细胞平均血红蛋白量（ MCH） MCH含量的计算见 公式（5）： MCH （pg）= HB / RBC × 1012 ……… …………… ………（5） 式中： HB——血红蛋白； RBC ——血细胞计数 ； 1012—— g和pg单位转换 。 13 白细胞计数（ WBC） 13.1 Natt-He