ICS 07.100 CCS CAV C 10 团体 标准 T/CAV 022—2025 人副流感病毒核酸检测技术指南 Technical Guidelines for Human Parainfluenza Virus Nucleic Acid Detection 2025 - 04 - 23发布 2025 - 04 - 23实施 中国疫苗行业协会 发布 全国团体标准信息平台 T/CAV 022 —2025 I 目次 前言 ................................ ................................ ................. II 引言 ................................ ................................ ................ III 1 范围 ................................ ................................ ............... 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ ..... 1 3 术语和定义 ................................ ................................ ......... 1 4 缩略语 ................................ ................................ ............. 1 5 病毒核酸检测 ................................ ................................ ....... 1 附录 A（资料性） 痰液标本预处理 ................................ ...................... 4 附录 B（资料性） 引物和探针序列及 RT-PCR反应体系组成 ................................ . 5 参考文献 ................................ ................................ .............. 6 全国团体标准信息平台 T/CAV 022 —2025 II 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国 疾病预防控制中心病毒病预防控制所 提出。 本文件由中国疫苗行业协会归口。 本文件起草单位：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所、巨吉众合生物科技有限公司、首都医 科大学附属北京儿童医院、北京市疾病预防控制中心、北京市首都儿科研究所、河南省疾病预防控制中 心、内蒙古自治区疾病预防控制中心、江西省疾病预防控制中心、广州市妇女儿童医疗中心。 本文件主要起草人：毛乃颖、朱贞、张燕、姬奕昕、崔爱利、曹蕾、 江洁、刘莹、 谢正德、陈萌、 赵林清、徐瑾、田晓灵、李健雄、朱冰。 全国团体标准信息平台 T/CAV 022 —2025 III 引言 人副流感病毒是引发婴幼儿及青少年急性呼吸道感染的重要病原体。 国内外流行病学 监测数据显 示，在病毒性呼吸道感染住院病例中，人副流感病毒的疾病负担仅次于流感病毒、新型冠状病毒和人呼 吸道合胞病毒。目前，人副流感病毒已被列为 我国急性呼吸道传染病哨点监测的 重要病原体之一。 快速精准的人副流感病毒病原学检测方法对实现早期病例识别、优化临床干 预策略、降低重症风险 及疾病防控具有关键作用。实时荧光定量逆转录 -聚合酶链式反应因其高灵敏度与特异性，成为人副流 感病毒核酸检测最常用的实验室诊断方法。本技术指南 的制定旨在规范人副流感病毒核酸检测方法， 提 供标准化的实验室技术 参考，支持不同检测试剂的性能评估，从而进一步 提升全国监测数据质量， 为科 学防控人副流感病毒相关传染性疾病 提供依据 。 全国团体标准信息平台 T/CAV 022 —2025 1 人副流感病毒核酸检测技术指南 1 范围 本文件规定了人副流感病毒核酸检测的操作方法和生物安全等内容。 本文件适用于人呼吸道标本中人副流感病毒的核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 WS 233 病原微生物实验室生物安全通用准则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 人副流感病毒 Human parainfluenza virus ，HPIV 主要引起人 类呼吸道感染 的单股负链有膜 RNA病毒。 人副流感病毒血清型 Serotype of HPIV 依据血清学特征和基因组差异， HPIV可以分为 HPIV1、HPIV2、HPIV3和HPIV4四种血清型，其中 HPIV1和HPIV3属于呼吸道病毒属， HPIV2和HPIV4属于腮腺炎病毒属。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct值：荧光信号超过背景阈值所经历的循环数（ cycle threshold value ） Real-time RT -PCR：实时荧光定量逆转录 -聚合酶链反应（ real-time fluorescence quantita tive reverse - transcription polymerase chain reaction ） RNA：核糖核酸（ ribonucleic acid ） RNase：核糖核酸酶（ ribonuclease ） RNase P：核糖核酸酶 P （ribonuclease P ） 5 病毒核酸检测 标本处理和保存 5.1.1 呼吸道标本（含鼻拭子、咽拭子、鼻咽拭子、支气管肺泡灌洗液、鼻咽吸取物及气管吸取物等） 采集后无需预处理，可直接进行病毒 RNA提取。 5.1.2 痰液标本需经蛋白酶 K消化或痰液消化液预处理（见附录 A）后进行病毒 RNA提取。 5.1.3 标本采集后 24 h内检测，需于 2 ℃～8 ℃保存；若无法在 24 h内完成检测，应于 -60 ℃～-80 ℃ 超低温环境保存。 核酸提取 病毒 RNA提取应严格遵循试剂盒 或全自动核酸提取仪 操作说明执行，若计划在 24 h内使用，需于 2 ℃～8 ℃保存；如需长期保存，应于 -60 ℃～-80 ℃超低温环境 保存，避免反复冻融。 全国团体标准信息平台 T/CAV 022 —2025 2 引物和探针 合成四种血清型 HPIV的特异性引物和探针，探针分别标记不同的荧光报告基团，用于不同血清型 HPIV的核酸检测（见附录 B.1）。 反应体系 配制 HPIV四种血清型单通道核酸检测 Real-time RT -PCR反应体系，包含预混反应缓冲液、逆转录 / 聚合酶混合液、血清型特异性引物（终浓度 400 nM）、TaqMan探针（终浓度 200 nM）、RNase -free水等 组份，加入 5.2核酸提取后的病毒 RNA模板。具体反应体系设置见附录 B.2。如果使用商品化试剂盒，反 应体系、反应条件和结果判定则以厂家说明书为准。 反应条件 5.5.1 第一阶段，反转录 45 ℃、5 min。 5.5.2 第二阶段，预变性 95 ℃、5 min。 5.5.3 第三阶段， 95 ℃、15 s，57 ℃、34 s，40个循环，在第三阶段每个循环的退火 延伸时收集荧光。 荧光检测模式为 FAM荧光（ HPIV1）、 VIC荧光（ HPIV2）、 CY5荧光（ HPIV3）、 Texas Red 荧光 （HPIV4）。 结果判定 5.6.1 Ct值＜ 35.0，出现典型的 S型扩增曲线，有明显的指数增长期，判定为阳性。 5.6.2 Ct值＞ 38.0或无数值，扩增曲线无指数增长期，判定为阴性。 5.6.3 35.0≤Ct值≤38.0，判定为可疑，应对原标本重复检测。若重做结果 Ct值≤38.0，扩增曲线有明显 起峰，判定为阳性，否则为阴性。 质量控制 5.7.1 设立阴性对照、阳性对照和提取对照监测核酸检测有效性；设立 RNase P 对照监测采集的标本 质量。 a) 阴性对照无 Ct值并且无扩增曲线。 b) 阳性对照 Ct值<35.0，并且出现典型的 S型扩增曲线。 c) 提取对照无 Ct值并且无扩增曲线。 d) RNase P对照检测结果 阳性代表采集的标本质量符合要求。在 HPIV核酸检测结果判定为阴性 时， RNase P对照检测结果 阴性代表采集的标本质量不符合要求。 5.7.2 定期校准和维护荧光定量 PCR仪、核酸提取仪、移液器等相关仪