ICS 07.100 CCS CAV T/CAS C 10 团体 标准 T/CAV 020—2025 T/CAS 1052—2025 人呼吸道合胞病毒中和抗体检测技术指南 Guidelines for detection of neutralizing antibody to human respiratory syncytial virus 2025 - 04 - 23发布 2025 - 04 - 23实施 中国疫苗行业协会 中国标准化协会 联 合 发布 全国团体标准信息平台 T/CAV 020 —2025 T/CAS 1052 —2025 I 目次 前言 ................................ ................................ ................. II 引言 ................................ ................................ ................ III 1 范围 ................................ ................................ ............... 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ ..... 1 3 术语和定义 ................................ ................................ ......... 1 4 缩略语 ................................ ................................ ............. 1 5 试剂材料 ................................ ................................ ........... 1 6 器材和设备 ................................ ................................ ......... 2 7 实验操作 ................................ ................................ ........... 2 8 结果观察与判定 ................................ ................................ ..... 4 9 实验室生物安全要求 ................................ ................................ . 4 附录 A（资料性） 试剂配制 ................................ ............................ 5 附录 B（资料性） 血清稀释及 96 孔细胞培养板加样示例 ................................ ... 6 参考文献 ................................ ................................ .............. 7 全国团体标准信息平台 T/CAV 020 —2025 T/CAS 1052 —2025 II 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所 提出。 本文件由中国疫苗行业协会归口。 本文件起草单位：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所、北京市疾病预防控制中心、内 蒙古 自治区疾病预防控制中心、 江苏省疾病预防控制中心、 湖北省疾病预防控制中心、 广州海关技术中 心、 长春百克生物科技股份公司、江西省疾病预防控制中心、广州市 妇女儿童医疗中心。 本文件主要起草人：张燕、房琼琼、李海、朱贞、田晓灵、毛乃颖、崔爱利、潘红星、杨北方、 张 璐、姜春来、曹蕾、夏百成、 胡宏俏、 袁若森、刘师文、朱冰。 全国团体标准信息平台 T/CAV 020 —2025 T/CAS 1052 —2025 III 引言 人呼吸道合胞病毒是全球范围内婴幼儿急性呼吸道感染的主要病原体之一。尽管疫苗和单克隆抗 体研发取得了一定的进展， 但这些预防性产品的评价仍面临许多挑战。 而评估疫苗和单克隆抗体的效果， 准确可靠的中和抗体检测方法至关重要。目前，人呼吸道合胞病毒中和抗体的检测方法多种多样，主要 包括微量中和实验和噬斑减少中和实验。微量中和实验对于某些病变不明显的人呼吸道合胞病毒毒株 滴度测定并不适用。 相比之下，基于酶联免疫染色的噬斑减少中和实验通过显色底物与辣根过氧化物酶结合，形成可视 化沉淀，能够高效且直观地检测血清中的中和抗体滴度。该 方法具有较高的精密度、特异性和准确性， 且具有较强的重复性，能够在无需复杂设备的情况下准确评估中和抗体的滴度，适用于各种人呼吸道合 胞病毒毒株和不同来源血清标本的检测。基于这些优势，本文件制定了用于人呼吸道合胞病毒血清中和 抗体测定的噬斑减少中和实验的标准操作技术指南。 全国团体标准信息平台 T/CAV 020 —2025 T/CAS 1052 —2025 1 人呼吸道合胞病毒中和抗体检测技术指南 1 范围 本文件规定了用于人呼吸道合胞病毒血清中和抗体测定的噬斑减少中和实验的操作流程及结果判 定标准。 本文件适用于人呼吸道合胞病毒中和抗体的 定性检测和 定量测定。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 中和抗体 neutralizing antibody 可与病原微生物及其产物特异性结合并发挥中和作用的抗体。 噬斑 plaque 当病毒感染一种敏感细胞时，增殖的病毒通过扩散感染邻近细胞，形成与噬菌斑相似的斑。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 FBS：胎牛血清（ Fetal Bovine Serum ） HRSV：人呼吸道合胞病毒（ Human Respiratory Syncytial Vi rus） HEp-2：人喉表皮样癌细胞（ Human Larynx Epidermoid Carcinoma Cells ） HRP：辣根过氧化物酶（ Horseradish Peroxidase ） PRNT：噬斑减少中和实验（ Plaque Reduction Neutralization Test ） PBST：含 0.05%吐温 20的磷酸盐缓冲液（ Phosphate -Buffered Saline with 0.05% Tween 20 ） PFU：噬斑形成单位（ Plaque Forming Unit ） 5 试剂材料 PBST：配制参照附录 A.1。 青-链霉素：配制参照附录 A.2。 维持液：配制参照附录 A.3。 培养液：配制参照附录 A.4。 覆盖物：配制参照附录 A.5。 水： GB/T 6682 -2008，二级水。 固定液： 4%多聚甲醛。 HRSV毒株：标准毒株或流行毒株。 HEp-2细胞 来源于 ATCC，细胞代次控制在 30代以内，定期检测细胞形态和活力，确保细胞生长状态及病毒感 染敏感性稳定。 一抗：单克隆抗体 Palivizumab 。 全国团体标准信息平台 T/CAV 020 —2025 T/CAS 1052 —2025 2 二抗： HRP标记山羊抗人 IgG。 TrueBlue 显色液。 6 器材和设备 96孔细胞培养 板。 台式低速离心机。 CO 2培养箱。 细胞计数器。 II级生物安全柜。 全自动洗板机。 恒温水浴箱。 分析天平。 微量移液器：单通道、多通道。 倒置显微镜。 酶联免疫斑点分析仪。 7 实验操作 病毒培养 HEp-2细胞经 0.25%的胰酶消化后， 用培养液 将HEp-2细胞密度 调整至2× 105个/mL，于37 ℃ 5%CO 2 培养箱培养 12 h～16 h。将 HRSV接种于 HEp-2细胞， 37 ℃吸附 1 h后，加入维持液继续培养，逐日观察 细胞病变，细胞圆化、皱缩且融合形成合胞体，随后逐渐脱落。当细胞出现 90%以上病变，离心收获病 毒上清，加入等体积的 FBS，分装至冻存管（ 1 mL/管），超低温保存备用。 病毒滴度测定 7.2.1 细胞铺板 用培养液 将HEp-2细胞密度 调整至2× 105个/mL，随后接种于96孔细胞培养板，每孔加 100 μL细胞悬 液，于37 ℃ 5%CO 2培养箱培养 10 h～12 h，第二天在倒置显微镜下观察细胞状态，确保细胞形态正常、 贴壁