SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2797—2011 食品中致泻大肠埃希氏菌检测 MPCR-DHPLC 法 Detection of diarrheagenic Escherichia coli in food- MPCR-DHPLC method 行业标准信息服务平台 2011-02-25发布 2011-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2797—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准主要起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国西藏出入境检验检 疫局、中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、北京盈九思科技发展有限公司。 本标准主要起草人：徐君怡、曹际娟、郑秋月、王顺芝、高小博、李苏龙、李建民、王秋艳、赤列加措。 行业标准信息服务平台 SN/T 2797—2011 食品中致泻大肠埃希氏菌检测 MPCR-DHPLC 法 1范围 本标准规定了食品中致泻性大肠埃希氏菌，包括肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠出血性 大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌的MPCR-DHPLC检测方法。 本标准适用于食品中致泻性大肠埃希氏菌，包括肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠出血性 大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌的MPCR-DHPLC快速检测。 2天 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T4789.6食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 SN/T0973进出口肉及肉制品中肠出血性大肠杆菌O157：H7检验方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR(polymerasechainreaction）：聚合酶链式反应 MPCR(multiplex PCR):多重 PCR DHPLC（denaturinghighperformanceliquidchromatography）：变性高效液相色谱 TEAA：三乙基铵乙酸盐 4 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置。应按 照GB19489的有关规定执行。 5废弃物处理和防止污染的措施 5.1检测过程中的废弃物需经121℃高压灭菌处理至少30min后再弃置。 5.2检测过程中防止交叉污染的措施参照标准GB/T27403的规定执行。 6原理 多重PCR，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上两对以上引物，同时 1 SN/T 2797—2011 扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。DHPLC分析 （TEAA），核苷酸片段分子中带负电荷的磷酸根基团与TEAA分子中带正电荷的氨基发生静电作用相 互吸引，同时TEAA分子中的三个乙基与固定相C18表面的烷基发生疏水作用力而相互吸引，通过流动 相中的乙的梯度洗脱达到将不同大小的核苷酸片段分离。 7试剂和材料 除另有规定外，所有试剂纯度应为色谱纯，水为灭菌超纯水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器 分装。 7.1水：应符合GB/T6682中一级水的规格。 7.2 Taq DNA 聚合酶。 7.3dNTP:dATP,dTTP,dCTP,dGTP。 7.410XPCR缓冲液:见A.1.1。 7.5引物：引物序列见表A.1。 7. 6 TE溶液：见A.1.2。 7.7 10% SDS。 7. 8 蛋白酶K（20mg/mL）。 7. 9 氯化钠溶液（NaCI)：5mol/L和0.7mol/L 7.1010%CTAB(十六烷基三甲基溴化胺）。 7. 11 三氯甲烷。 7.12异戊醇。 7.13酚。 行业标准信息服务平台 7. 14 异丙醇。 7. 157 70%乙醇。 7. 16 DHPLC缓冲液：见A.1.3。 7. 17 双料缓冲蛋白陈水：见A.1.4。 主要仪器和设备 8.1 PCR仪。 8.2 DHPLC仪。 8.3离心机（离心转速18000g）。 8.4PCR超净工作台。 8.5微量可调移液器和灭菌吸头：2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL。 8.6灭菌PCR反应管。 9方法提要与检测程序 9.1方法提要 本方法采用四重PCR同时扩增四种致泻性大肠埃希氏菌。四重PCR产物再利用DHPLC非变性 2