SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2774—2011 国境口岸鼠疫耶尔森菌蛋白悬浮芯片 检测方法 Detection method for Yersinia pestis by protein suspension array at frontier port 行业标准信息服务平台 2011-02-25发布 2011-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2774—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：王静、孙肖红、杨宇、杨永莉、胡孔新、文海燕。 行业标准信息服务平台 SN/T 2774—2011 国境口岸鼠疫耶尔森菌蛋白悬浮芯片 检测方法 1范围 本标准规定了国境口岸可疑物品或环境样品中鼠疫耶尔森菌的蛋白悬浮芯片检测方法，包括样品 处理、检测方法、结果判定及报告。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 人间传染的病原微生物名录（卫生部，2006年） 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 鼠疫耶尔森菌Yersiniapestis 鼠疫菌为耶尔森菌属由假结核菌进化而来的新生病原体，革兰氏染色阴性、不运动、不形成芽孢的 球杆菌，能够引发腺鼠疫、败血型鼠疫和肺鼠疫是生物战剂和生物恐怖的重要病原菌之一。 3. 2 鼠疫耶尔森菌F1抗原YersiniapestisF1antigen 疫菌主要的保护性抗原。人或动物感染鼠疫菌后，F1抗原在体内高度表达，具有明显抗吞噬和活化补 体的作用。鼠疫菌F1抗原具有抗原性强、特异性高等特点，检测F1抗原及其抗体是鼠疫诊断的重要 依据，也是目前公认的鼠疫菌种特异性抗原之一。 3.3 蛋白悬浮芯片proteinsuspensionarray 利用带编码的包覆荧光发色剂的微球为载体标定目标抗原或抗体，以报告分子（如：荧光染料）标记 目标抗原或抗体，流式细胞仪作为检测平台，可以对抗原或抗体等生物分子进行大规模检测的一种生物 芯片技术。 4仪器设备 悬浮芯片系统1、微孔滤板抽滤器、真空气泵、恒温振荡器、生物安全柜、离心机、荧光显微镜、超声 波清洗器、恒温培养箱、纯水机、漩涡混合仪、血球计数板。 1）Luminex100/200或等效设备。 1 SN/T2774—2011 5主要试剂与耗材 5.1试剂 生物素标记试剂盒：BiotinLabelingKit-SH（Pierce）2或等效试剂盒，微球交联试剂盒：AmineCou- plingKit(Bio-Rad）"或等效试剂盒，悬浮芯片仪校准试剂盒：Bio-PlexCalibrationKit(Bio-Rad)或等 效试剂盒，悬浮芯片仪校验试剂盒：Bio-PlexValidationKit(Bio-Rad）或等效试剂盒，兔抗鼠疫菌F1 抗原抗体（或等效抗体），鼠疫F1抗原单抗2F6（或等效抗体），藻红蛋白标记链霉亲和素（SA-PE），1-（3- 二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC)，牛血清白蛋白（BSA），N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo NHS），鸡IgG，兔抗鸡IgG，羊抗兔IgG，吐温-20。 其他所需缓冲溶液配制及要求参见附录A。 5.2耗材 羧基化编码微球，96孔滤板、消毒液：10%的次氯酸钠溶液（含有效氯>10%）、悬浮芯片仪样品流 路鞘液。 6抗体包被编码微球和生物素标记抗体 6.1活化编码微球 6.1.1取100μL编码微球到1.5mL离心管中，14000g离心4min，小心吸出上清液并弃去。 并弃去。 配制的Sulfo-NHS工作液，高速振荡30s后用铝箔包裹，在室温18℃～25℃振摇20min。 6.1.4加入150μL的PBS(pH7.4），振荡10s后，14000g离心4min，小心吸出上清液并弃去。 6.1.5重复6.1.4步骤一次。 6.1.6加人100μL的PBS(pH7.4)悬浮编码微球，中速振荡30s后，超声15s。 6.2抗体包被编码微球 6.2.1取溶于0.03mol/LPB缓冲液（pH7.2）免抗F1抗体12μg加入到活化后的编码微球中，用 PBS（pH7.4）定容至500μL，铝箔包裹在室温18℃~25℃振摇2h。然后14000g离心4min，小心吸 出上清液并弃去。 6.2.2加入500μL的PBS（pH7.4），振荡混匀，14000g离心4min，小心吸出上清液并弃去。 6.2.3加入250uL微球封闭缓冲液悬浮编码微球，中速振荡15s，用铝箔包裹，在室温18℃～25℃振 摇30min，14000g离心4min，小心吸出上清液并弃去。 6.2.4加入500μL微球保存液洗涤编码微球，16000g离心6min，小心吸出上清液并弃去。 6.2.5用150μL的微球保存液悬浮编码微球，于0℃4℃避光保存备用，有效期1年。 6.3包被微球的计数 吸取适量微球，稀释后，用血球计数板（0.10mm；1/400mm）在显微镜下计数，计算见式（1）： 2）、3）、4）、5）、6）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本文件的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其 他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2