SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2754.9—2011 出口食品中致病菌环介导恒温 扩增（LAMP）检测方法 第9部分：溶血性链球菌 Loop-mediated isothermal amplification detection method for pathogens inexportfoodPart 9:Streptococcus hemolyticus 业标准信息服务平台 2011-02-25发布 2011-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2754.9—2011 前言 SN/T2754《出口食品中致病菌环介导恒温扩增（LAMP）检测方法》共分为15个部分： 第1部分：金黄色葡萄球菌； 第2部分：大肠杆菌0157； 第3部分：志贺氏菌； 第4部分：单核细胞增生李斯特菌； 第5部分：副溶血性弧菌； 第6部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌； 第7部分：空肠弯曲菌； 第8部分：肺炎克雷伯氏菌； 第9部分：溶血性链球菌； 第10部分：产气荚膜梭菌； 第11部分：产霍乱毒素的霍乱弧菌； 第12部分：溶藻弧菌； 第13部分：创伤弧菌； 第14部分：假结核耶尔森氏菌； 第15部分：阪崎肠杆菌。 本部分为SN/T2754的第9部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫 局、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局、中华人民共和国广州华峰生物科技有限公司。 本部分主要起草人：王小玉、唐食明、游淑珠、杨一帆、李志勇、程洁、曹以诚、杜正平、李丹琳、冯家望、 信息服务平台 易敏英、曾静、陈洵、高东微。 I SN/T2754.9—2011 出口食品中致病菌环介导恒温 扩增（LAMP）检测方法 第9部分：溶血性链球菌 1范围 SN/T2754的本部分规定了检测出口食品中溶血性链球菌的环介导恒温核酸扩增（LAMP）法。 本部分适用于出口食品中溶血性链球菌的筛选检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T4789.11食品微生物学检验溶血性链球菌检验 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测溶血性链球菌，所有培养物和废弃物应 按照GB19489中的有关规定执行。 业标准信息服务平台 4 防污染措施 防止污染措施应符合GB/T27403的规定 5缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Betaine：甜菜碱 Bst酶[BstDNApolymerase(largefragment)]：BstDNA聚合酶（大片段） DNA（deoxyribonucleicacid)：脱氧核糖核酸 dNTP（deoxyribonucleosidetriphosphate）：脱氧核苷三磷酸 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)：乙二胺四乙酸 LAMP(loop-mediatedisothermalamplification）：环介导恒温扩增 TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚 6技术概要 根据溶血性链球菌属特有的靶序列ska基因（参见附录A)设计的两对特殊的内、外引物，特异性识 1 SN/T 2754.9—2011 别靶序列上的六个独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在ska基因序列启动互补链合成，在同 离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色 变化观察判定结果。 7试剂和材料 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。 7.1引物：根据溶血性链球菌属特有的靶序列ska基因设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2 和内引物1,内引物2。 外引物扩增片段长度：193bp。 内引1物1(FIP,5'-3'):TTGTTAGTATGGCCGGTATCGTTGTTTTCAGGTTGTGATGTTAGATCG 内引物2(BIP,5’-3'):GGCTGTTATTGATAGGTGGACGTTTTGTCGGTCCAAGCTATTGC 7.2DNA提取液:20 mmol/L Tris-HCl,2mmol/LEDTA,1.2% Triton X-100(pH8.0)。 7.310XThermoPol缓冲液含：0.2mol/LTris-HCl,0.1mol/L氯化钾，0.1mol/L硫酸铵，20mmol/L硫 酸镁，1%TritonX-100。 7.4dNTPs：每种核苷酸浓度10mmol/L。 7.5甜菜碱：浓度5mol/L。 7.6 硫酸镁（MgSO,）：浓度150mmol/L。 7.7 BstDNA聚合酶：酶浓度8U/uL。 7.8显色液：SYBRGreenI荧光染料，1000X。 7.9阳性对照：溶血性链球菌标准菌株，或含目的片段的DNA亦可。 7.10溶血性链球菌LAMP检测试剂盒，可选，参照试剂盒说明书操作。试剂盒组成及使用注意事 项参见附录B。 7.111.5mL塑料离心管。 8仪器和设备 8.2高速台式离心机：≥7000g。 8.3水浴锅或加热模块：65℃土1℃和100℃土1℃。 8.4计时器。 9检测程序 食品中溶血性链球菌LAMP检测程序见图1。 1）由广州华峰生物科技有限公司提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如 果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2