SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2754.7—2011 出口食品中致病菌环介导恒温 扩增（LAMP）检测方法 第7部分：空肠弯曲菌 Loop-mediated isothermal amplification detection method for pathogens in export food-Part 7:Campylobacter jejuni 业标准信息服务平台 2011-02-25发布 2011-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2754.7—2011 前言 SN/T2754《出口食品中致病菌环介导恒温扩增（LAMP）检测方法》共分为15个部分： 第1部分：金黄色葡萄球菌； 第2部分：大肠杆菌O157； 第3部分：志贺氏菌； 第4部分：单核细胞增生李斯特菌； 第5部分：副溶血性弧菌； 第6部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌； 一第7部分：空肠弯曲菌； 第8部分：肺炎克雷伯氏菌； 第9部分：溶血性链球菌； 第10部分：产气荚膜梭菌； 第11部分：产霍乱毒素的霍乱弧菌； 第12部分：溶藻弧菌； 第13部分：创伤弧菌； 第14部分：假结核耶尔森氏菌； 第15部分：阪崎肠杆菌。 本部分为SN/T2754的第7部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫 局、广州华峰生物科技有限公司、中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境 检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人 民共和国黑龙江出人境检验检疫局、中华人民共和国浙江出人境检验检疫局 本部分主要起草人：徐帮兴、肖进文、薛峰、李志勇、陈沟、曹以诚、谭志、郑文杰、张体银、王志强、 服务平台 李晓虹、易敏英、凌莉、曹际娟、江志毅、李苏龙、程洁、刘志强、高东微。 I SN/T 2754.7—2011 出口食品中致病菌环介导恒温 扩增（LAMP）检测方法 第7部分：空肠弯曲菌 1范围 本部分适用于出口食品中空肠弯曲菌的筛选检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T4789.9食品微生物学检验空肠弯曲菌检验 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测空肠弯曲菌，所有培养物和废弃物应按 标准信息服务平台 照GB19489中的有关规定执行。 4防污染措施 防止污染措施应符合GB/T27403的规定。 5缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Betaine：甜菜碱 Bst酶[BstDNApolymerase（largefragment)：BstDNA聚合酶（大片段） ccoN:空肠弯曲菌细胞色素C氧化酶I亚单位基因 DNA（deoxyribonucleicacid）：脱氧核糖核酸 dNTP（deoxyribonucleosidetriphosphate）：脱氧核苷三磷酸 EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid)：乙二胺四乙酸 LAMP（loop-mediatedisothermalamplification）：环介导恒温扩增 TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚 SN/T 2754.7—2011 6技术概要 根据空肠弯曲菌特有的靶序列ccoN基因（参见附录A）设计的两对特殊的内、外引物，特异性识别 靶序列上的六个独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在ccoN基因序列启动互补链合成，在同 变化观察判定结果。 7试剂和材料 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。 7.1引物：根据空肠弯曲菌特有的靶序列ccoN基因设计一套特异性引物，包括外引物1（F3），外引 物2（B3），内引物1（FIP），内引物2（BIP）。 外引物扩增片段长度：216bp。 F3(5'-3'):GAAGCGCTTTTTGGTTCTT B3(5'-3'):GGTATTACTCAAGGTATGATGTG FIP(5’-3'):GGTGGATTGTTGTATCTTATCGGTTTTTTTATCAAGCACTCTTCCACAAG BIP(5'-3'):ATAAGGAACAATAGCCACAACAGTTTTTGCGACAGATGAGTATGGTAAC 7.21o×ThermoPol缓冲液含：0.2 mol/LTris-HCl,0.1mol/L氯化钾，0.1mol/L硫酸铵， 20mmol/L硫酸镁,1%TritonX-100。 7.3dNTPs：每种核苷酸浓度10mmol/L。 7.4甜菜碱：浓度5mol/L。 7.5 硫酸镁（MgSO4）：浓度150mmol/L。 7.6 BstDNA聚合酶：酶浓度8U/μL。 7.7 阳性对照：空肠弯曲菌标准菌株，或含目的片段的DNA 7.81 DNA提取液:20 mmol/L Tris-HCl,2mmol/L EDTA,1.2%Triton X-100(pH8.0)。 7.9 显色液：SYBRGreenI荧光染料，1o00X。 7.101.5mL塑料离心管。 7. 11 意服务平台 空肠弯曲菌LAMP检测试剂盒”，参照试剂盒说明书操作。试剂盒组成及使用注意事项参见附录B。 8 仪器和设备 8.1移液器：量程0.5μL~10μL，量程10μL~100μL，量程100μL~1000μl 8.2高速台式离心机：≥7000g。 8.3水浴锅或加热模块：65℃±1℃和100℃土1℃。 8.4计时器。 9检测程序 食品中空肠弯曲菌LAMP检测程序见图1。 1）由广州华峰生物科技有限公司提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如 果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2