B38 唐山市地方标准DB1302 DB1302/T474—2017 柴胡根腐病菌鉴定方法 2017-12-20发布 2018-01-01实施 唐山市质量技术监督局发布DB1302/T474—2017 前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由唐山市质量技术监督局提出。 本标准起草单位：唐山师范学院。 本标准主要起草人：客绍英、姜峰、马艳芝、王晓英、段英姿、张胜珍。DB1302/T474—2017 柴胡根腐病菌鉴定方法 1范围 本标准规定了柴胡根腐病菌（FusariumsolaniWill）鉴定的方法原理、仪器设备和试验用具、试 剂和培养基、田间取样、病原菌的分离与培养、病原菌形态学鉴定及病原菌特征判断、分子生物学鉴定、 结果判定等。 本标准适用于镰刀菌属为主要致病菌的柴胡根腐病菌检测和鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ITS（InternalTranscribedSpacer）：内转录间隔区 PCR（PolymeraseChainReaction）：聚合酶链式反应 BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）：局部序列比对基本检索工具 4方法原理 根据茄腐镰刀菌在柴胡根茎交界处的症状、病原菌的形态特征、生物学特性和PCR特异性反应对病原 菌进行鉴定。 5仪器设备和试验用具 显微镜、超净工作台、恒温培养箱、冰箱、高压灭菌锅、高速冷冻离心机、PCR仪、核酸电泳仪、凝 胶成像系统、微量移液器、载玻片、盖玻片、滴管、培养皿、镊子、解剖刀、酒精灯、医用解剖剪等。 6试剂和培养基 无菌双蒸水、液氮、蛋白酶K、盐酸、氢氧化钠、乙酸铵、氯化钠、TAE缓冲液、无水乙醇、溴化乙 锭、三氯甲烷、异丙醇、异戊醇、TE缓冲液（pH8.0）、PCR试剂（包括TaqDNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲 液）、葡萄糖、五氯硝基苯（PCNB）、硫酸链霉素、20%乳酸、除另有规定外，所有试剂均为分析纯，所有 试验用水均为无菌双蒸水。 培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）和PCNB酸性马铃薯葡萄糖选择性培养基培养基，配制方法 见附录A。 7田间取样 重点检查根茎交界处，病症是在根茎交界处根组织变粗，颜色变深，质地变脆，并且在表面有裂隙。DB1302/T474—2017 将可疑发病柴胡植株连根拔出，轻轻抖动去除表土，送实验室做进一步的检验。 取样方法和步骤按SN/T2122规定执行。 8病原菌的分离与培养 切取病健交界部位组织（约0.5cm×0.5cm），用0.1%次氯酸钠溶液等消毒液表面消毒5min～10min （根据分离组织的腐败程度可以适当增加或缩短表面消毒时间），无菌水冲洗2次～3次，用无菌滤纸吸干 水分后，在无菌操作条件下，置于PCNB酸性马铃薯葡萄糖选择性培养基平板上，25℃～28℃培养2d～ 3d。发现有灰白色菌丝长出，立即挑取菌落边缘菌丝，转入PDA平板纯化并保存。 9病原菌形态学鉴定及病原菌特征判断 将分离获得的候选真菌分别在PDA培养基上25℃培养7d，观察菌落形态、颜色；用显微镜观察候 选真菌分生孢子形态、隔膜有无及数目、产孢结构、厚垣孢子有无及着生部位等。 病原菌在PDA培养基上蔓延生长，菌丝呈白色绒毛状，不易产孢子。镜检可以看见大量分生孢子和分 生孢子梗。分生孢子梗伸长、不分枝；小型分生孢子长椭圆形、肾形，单胞或双胞，数量大，呈假头状聚 生；大型分生孢子镰刀形，两端较钝，顶胞稍弯，具1隔～6隔，其中3隔膜占总数的99%以上；厚垣孢子球 形，表面光滑或粗糙，顶生或间生于菌丝中。见附录B。 10分子生物学鉴定 形态学鉴定后还需进行PCR鉴定，PCR鉴定方法见附录C。茄腐镰刀菌通用引物ITS1和ITS4的序列见附 录D。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下从凝胶中切取目标条带并测序分析。 测序结果经BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)与NCBI数据库中的已知序列进行同源性比 较。 11结果判定 根据茄腐镰刀菌的鉴定特征和PCR比对结果对病原菌分离物进行综合判断，如病原菌特征符合第9章的 描述，并且序列比对相似度与已报道的茄腐镰刀菌超过99%，可以确定为茄腐镰刀菌。DB1302/T474—2017 附录A （规范性附录） 试剂和培养基配制 A.1PDA培养基 马铃薯 200g 葡萄糖 10g 琼脂 18g 称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮沸30min，用四层纱布过滤，滤液加如葡萄糖20g， 琼脂18g，加热搅拌混匀，稍冷却后定容至1000mL，分装三角瓶，加塞、包扎，121℃高压灭菌20min。 A.2PCNB培养基 马铃薯 200g 葡萄糖 10g 琼脂 18g 硫酸链霉素 0.3g 五氯硝基苯 0.3g 蒸馏水 1000mL 配制方法前面步骤同A.1，待定容至1000mL后，用乳酸（20%）将pH值调至4.0，分装于三角瓶中， 121℃高压灭菌20min。培养基冷却至45℃时无菌操作下添加硫酸链霉素和五氯硝基苯并混匀，将大约 15mL的培养基倒入无菌平板中，静置冷却备用。DB1302/T474—2017 附录B （规范性附录） 柴胡根腐病典型症状及病原菌形态特征 B.1柴胡根腐病典型特征 柴胡根腐病为土传病害。在唐山玉田地区一般6月中下旬随着雨水增多开始发病，7月中下旬为发病 盛期。当年生柴胡即有发病，如果不采取措施，第二年发病情况加重。高温、高湿、多雨的年份发病重， 反之则发病较轻。根腐病主要造成柴胡根部腐烂，之后整个植株萎蔫死亡。发病初期，柴胡根部在病原菌 侵入点开始腐烂，而地上部分发病株与健康株之间无明显区别，之后随着根部腐烂情况加重，在根茎交界 处可以看到黑褐色的病斑并逐渐扩大，更进一步根部完全腐烂，整个植株萎蔫死亡（图1）。 B.2菌落形态观察 分离纯化的菌株在PDA培养基上蔓延生长，气生菌丝呈白色绒毛状，不易产孢（图2）。从PDA培养基 上挑取少量菌丝,镜检发现大量分生孢子和分生孢子梗。分生孢子梗伸长、不分枝；小型分生孢子长椭圆 形、肾形，单胞或双胞，数量大，呈假头状聚生；大型分生孢子镰刀形，两端较钝，顶胞稍弯，具1隔～ 6隔，其中3隔膜占总数的99%以上；厚垣孢子球形，表面光滑或粗糙，顶生或间生于菌丝中（图3）。 图1柴胡根腐病典型特征图2病原菌在PDA培养基上 的形态学特征图3病原菌不同类型的孢子 A.大型分生孢子B.大型分生孢子簇DB1302/T474—2017 附录C （规范性附录） 茄腐镰刀菌的PCR鉴定 C.1TES提取缓冲液 100mmol/LTris-HCl(pH8.0)、10mmol/LEDTA（乙二胺四乙酸钠）、2%SDS（质量浓度）。 C.2CTAB提取液 称取CTAB2g加入蒸馏水40mL，加入1mol/LTris-Cl(pH8.0)10mL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)4mL 和5mol/LNaCl溶液28mL，待CTAB溶解后用蒸馏水定容至100mL。 C.350×TAE电泳缓冲液 称量下列试剂，置于1L烧杯中。 Tris：242g Na2EDTA·2H2O：37.2g 向烧杯中加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。加入57.1mL的醋酸，充分搅拌。加去离子水将 溶液定容至1L后，室温保存。使用时用无菌水稀释50倍即1×TAE电泳缓冲液。 C.4DNA提取 应用CTAB法或市售真菌基因组DNA提取试剂盒提取。 CTAB法具体步骤如下： a)收集新鲜的菌丝体约0.5g放入1.5mL浸在液氮里的离心管中，用塑料杵研碎待用。 b)离心管中加入1mLTES提取缓冲液，另加入100mg～200mg蛋白酶K，55℃保温30min，期间 轻轻混匀。 c)加入CTAB提取液200μL，65℃保温10min。 d)4℃12000rpm离心10min，保留上清液。 e)加入等体积的三氯甲烷/异戊醇（体积比24:1），轻轻混匀，冰浴30min；4℃12000rpm离心10 min，保留上清液。 f)加入上清液1/3体积的3mol/LNaAc溶液。加入800mL-20℃预冷的无水乙醇，混匀后置于-20℃ 放置20min。 g)12000rpm，离心10min，弃上清。 h)向离心管中加入75%的乙醇轻轻洗涤2次～3次，置于吸水纸上倒置晾干或自然风干成透明状。 i)向离心管中加入100μLTE缓冲液（pH8.0）溶解DNA，-20℃保存备用。 PCR检测 PCR反应体系为25μL，包括：10×PCRBuffer(含Mg2+)2.5μL，dNTP(2.5mmol/L)1μL，模板 DNA(约30ng)1μL，引物ITS1和ITS4(10μmol/L)各1μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，ddH2O 18.3μL；同时要设置阳性对照，阴性对照，空白对照（以无菌水替代DNA样品）。 扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环； 最后72℃延伸10min。 C.5产物检测 在1×TAE电泳缓冲液中，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，5V/cm恒压，电泳30min～45min，0.5%EB染色 10min，电泳结果用凝胶成像系统拍照并记录结果。DB1302/T474—2017 附录D （规范性附录） 茄腐镰刀菌ITS引物序列及电