B30 唐山市地方标准DB1302 DB1302/T471—2017 柑橘类水果中橘红2号的测定 液相色谱串联质谱法 2017-12-20发布 2018-01-01实施 唐山市质量技术监督局发布DB1302/T471—2017 前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由唐山市质量技术监督局提出。 本标准由唐山市农牧局归口。 本标准起草单位：唐山市畜牧水产品质量监测中心。 本标准起草人：周鑫、张立田、段晓然、项爱丽、汤思凝、蒙君丽、张建雄、阴明杰、庞学良。DB1302/T471—2017 柑橘类水果中橘红2号的测定液相色谱串联质谱法 1范围 本标准规定了液相色谱串联质谱法测定鲜柑橘类水果中橘红2号。 本标准适用于鲜柑橘类水果中橘红2号残留量的测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡 是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单或修订版）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规则和试验方法 3原理 试样经乙腈提取，NH2固相萃取柱净化，浓缩定容后经液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水为GB/T6682规定的一级水。 4.1试剂 4.1.1甲醇：色谱纯。 4.1.2乙腈：色谱纯。 4.1.3甲酸：色谱纯。 4.1.4乙酸乙酯：色谱纯。 4.1.5氯化钠。 4.2试剂配制 4.2.1乙酸乙酯甲醇溶液：（乙酸乙酯:甲醇=9:1，V:V） 4.2.270%乙腈溶液：（乙腈:水=7:3，V:V） 4.3标准品 橘红2号标准品（CitrusRed2，CAS：6358-53-8），纯度≥99%。 4.4标准溶液配制 4.4.1橘红2号标准储备液：称取橘红2号标准品约10mg，精确至0.01mg，置于10mL容量瓶中，甲醇定容至 刻度，配置成1mg/mL浓度的储备液，-18℃保存。 4.4.2橘红2号标准中间液：用甲醇稀释橘红2号标准储备液至10μg/mL。DB1302/T471—2017 4.4.3橘红2号标准工作液：用甲醇稀释橘红2号标准中间液至100ng/mL。 4.5材料 4.5.1NH2固相萃取柱（500mg，6mL）或相当者。 4.5.2滤膜：0.22μm。 5仪器和设备 5.1液相色谱-质谱/质谱仪（LC-MS/MS）：配有电喷雾离子源(ESI)。 5.2分析天平：感量为0.00001g和0.01g。 5.3离心机：转速不低于6000r/min。 5.4固相萃取装置。 5.5旋转蒸发仪。 5.6涡旋混合器。 5.7组织捣碎机。 5.8具塞塑料离心管：50mL。 6试样制备 取适量新鲜的样品，去叶、梗后均质处理，-18℃冷冻保存，备用。 7分析步骤 7.1提取 准确称取4g（精确至0.01g）试样，置于50mL聚丙烯具塞离心管中，加入20mL乙腈，涡旋振荡1min， 加入4g氯化钠，再涡旋30s，于6000r/min离心10min。准确吸取10.00mL乙腈层于鸡心瓶中，40℃旋转蒸发 至近干，加入乙酸乙酯甲醇溶液(4.2.1)5mL，充分混合溶解。 7.2净化 用5mL甲醇活化NH2固相萃取柱，将提取液(7.1)过柱，用乙酸乙酯甲醇溶液(4.2.1)淋洗固相萃取柱两次， 每次5mL，抽干，收集全部流出液，于40℃旋转蒸发至干，1.00mL70%乙腈（4.2.2）定容，涡旋溶解，过0.22 μm滤膜，待上机。 7.3基质标准溶液的制备 取阴性柑橘样品按照7.1、7.2的操作步骤进行，用最终所得的定容液配制基质标准溶液。 7.4测定条件 7.4.1液相色谱参考条件DB1302/T471—2017 a)色谱柱：ShimadzuODS-ⅢC18，100mm×2.1mm，1.6μm，或者相当； b)柱温：40℃； c)进样量：5μL； d)流动相：A，0.1%甲酸水溶液；B，乙腈； e)流动相条件：流速0.3mL/min，洗脱程序见表1。 表1液相色谱梯度洗脱条件 时间(min) 0.0 0.8 2.0 2.5 2.6 2.8 0.1%甲酸水溶液（%） 30 30 0 0 30 30 乙腈（%） 70 70 100 100 70 70 7.4.2质谱参考条件 a)离子源：电喷雾离子源（ESI）； b)扫描方式：正离子扫描； c)检测方式：多反应监测（MRM）； d)电喷雾电压（IS）：5000v； e)气帘气：20psi； f)雾化气：40psi； g)辅助气：40psi； h)雾化温度：500℃； i)橘红2号的质谱参数见表2。 表2橘红2号质谱参数 化合物名称母离子 （m/z）子离子 （m/z）去簇电压 （DP）/V碰撞能量 （CE）/V入口电位（EP） /V出口电位 （CXP）/V 橘红2号 309.3153.3* 277.996 9623 1710 108 12 “*”表示定量子离子 7.5液相色谱—串联质谱测定 7.5.1定性确证 被测化合物选择1个母离子，2个子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与混合基质标 准校准溶液中对应组分的保留时间偏差在±2.5%之内；且样品谱图中组分的相对离子丰度与浓度接近的基质 标准校正溶液谱图中对应的相对离子丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定样品中存在对应的 待测物。DB1302/T471—2017 表3定性确证——相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度K K>50 20<K<50 10<K<20 K<10 允许最大偏差 ±20 ±25 ±30 ±50 7.5.2定量测定 外标法定量：在仪器最佳工作条件下，对橘红2号基质标准校正溶液进行测定，以基质标准校正溶液浓度 为横坐标，以定量离子峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对待测样品进行定量，样品溶 液中待测物的响应值应在仪器测定的线性范围内。橘红2号的多反应监测（MRM）色谱图见附录A。 7.6平行试验 按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。 7.7空白试验 不称取样品，其余均按照试样步骤进行。 7.8回收率试验 阴性样品中添加标准溶液，按照7.1和7.2操作，测定后计算样品添加的回收率。 8结果计算 橘红2号的测定结果按式（1）计算： c1000 1000VfXm  ……………………………………………（1） 式中： X——试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（μg/kg）； c——从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V——样品溶液最终定容体积，单位为毫升（mL）； f——稀释因子； m——称样量，单位为克（g）； 1000——单位转换。 计算结果应扣除空白值，保留3位有效数字。 9灵敏度、准确度和精密度 9.1灵敏度 橘红2号在鲜柑橘类水果中的检出限为0.5μg/kg。DB1302/T471—2017 9.2回收率和精密度 见表4。 表4橘红2号在鲜柑橘类水果中的平均回收率和精密度（n=6） 化合物名称 添加浓度/（μg/kg） 回收率/% 精密度/% 橘红2号CitrusRed21 10 2087.5 91.1 90.15.99 3.02 4.92DB1302/T471—2017 附录A （资料性附录） 橘红2号液相色谱—质谱/质谱多反应监测色谱图 图A.1橘红2号总离子流色谱图 图A.2橘红2号定量离子色谱图309.3>153.3