ICS 11.040.40 YY C 45 中华人民共和国医药行业标准 YY/T 1562—2017 组织工程医疗器械产品 生物材料支架 细胞活性试验指南 Tissue engineeringmedical device productsBiomaterial scaffolds- Guide for cell viability evaluation 2017-03-28发布 2018-04-01实施 发布 国家食品药品监督管理总局 YY/T1562—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家食品药品监督管理总局提出。 本标准由全国外科植人物和矫形器械标准化技术委员会组织工程医疗器械产品分技术委员会 (SAC/TC110/SC3)归口。 本标准起草单位：中国人民解放军第四军医大学、中国食品药品检定研究院。 本标准主要起草人：金岩、张勇杰、徐丽明、罗海浪、邵安良、方玉、付海洋。 I YY/T1562—2017 引言 活性细胞和无活性细胞在生物材料支架表面或内部的数量和分布是决定细胞/生物材料支架构建 物产品性能的重要特征之一，也是评价生物材料支架的细胞相容性的指标之一。因此，作为用于修复与 再生缺损或疾病组织的组织工程产品的重要参数，有必要对细胞活性定量检测的方法进行标准化 受其他参数的影响。推荐使用其他检测方法以评估和确定细胞类型、蛋白表达、基因图谱、分化过程及 程度、活化状态、形态等特性。 建议在使用生物材料支架复合细胞之前，按照相关要求完成生物材料支架的生物相容性基本检测 YY/T1562—2017 组织工程医疗器械产品生物材料支架 细胞活性试验指南 1范围 本标准给出了对生物材料支架进行生物学评价时的细胞活性评价指南。 本标准适用于组织工程医疗器械产品的生物材料支架 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 YY/T0606.25 组织工程医疗产品第25部分：动物源性生物材料DNA残留量测定法：荧光染 色法 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 活性细胞 viable cell 能够进行新陈代谢活动，结构完整，具有功能细胞膜的细胞。 3.1.2 无活性细胞 non-viablecell 不符合3.1.1中列出的活性标准的任何一项要求的细胞。 3.1.3 生物材料支架 biomaterial scaffolds 具有细胞或生物活性因子迁移、结合或输送功能，用来替代、修复或再生组织的支持物、释放载体或 基质，用以诊断、治疗、修复或替换机体组织、器官或增进其功能， 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BrdU：溴脱氧尿苷（5-bromo-2-deoxyUridine）； calceinAM：钙荧光素乙酰氧基甲酯（calceinacetoxymethylester）； DAPI：4，6-二胖基-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole）； G6PD：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphatedehydrogenase）； LDH：乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase)； 1 YY/T1562—2017 MTT：3-L4，5-二甲基噻唑-2」-2，5-二苯基四氮唑漠盐3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide); MTS:3-（4,5-二甲基吡啶-2-苯基)-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺苯基)-2H-四唑内盐[3-（4，5- dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetraolium, inner salt]; WST：2-（4-碘苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺基苯基）-2H-四唑盐1-2-（4-lodophenyl)-3-（4-ni- trophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium); XTT：2,3-双（2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基）-2H-四唑-5-羧酰苯胺2，3-Bis（2-methoxy-4-nitro-5- sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide)。 4概述 本标准概述了定量检测有孔或无孔、坚硬的或柔软的生物材料支架内部或表面活性细胞和无活性 细胞的数量及分布的常用方法。这些方法既可以用于测定生长在完整三维生物材料支架或基质内的细 胞（非破坏性方法），也可以用于已经从支架或者基质中提取的细胞（破坏性方法）。 除了提供现有技术的概述，本标准也描述了生物材料支架与细胞活性试验特定的相互作用，这些相 胞活性试验相互作用产生的干扰。 本标准中大多数方法来源于二维培养的细胞数量分析，但是经过调整已能够用于分析三维构建物 内细胞的情况。本标准探讨了这些方法的机理和灵敏度。部分试验采用二维培养的细胞建立标准曲 线，由此产生的局限性在本标准中也有所说明。此外，本标准中还就生物材料支架本身对活性检测试验 影响进行了阐述。 当多种测试方法组合使用时，可更为精确地测量活性细胞、无活性细胞的数量和分布。 目前，有多种静态或动态方法将细胞接种在生物材料支架上。每种方法有不同的细胞接种效率。 总体来说，静态方法相比动态方法的接种效率要低。本标准阐述的方法能够协助建立起细胞接种方法 与接种效率的关系，并且能够对特定接种方法下的活性细胞数量进行标准化检测。 在培养或移植过程中，较厚的生物材料支架或者富含细胞的生物材料支架会导致传质障碍（物质扩 散受限），造成构建物中央的细胞死亡，只有外缘有活性细胞。这种活性细胞的空间分布差异可采用本 标准中的检测方法进行定量。另外，培养方法或者生物反应器条件对于材料内部细胞活性的影响同样 能够通过本标准中的方法进行评估。 5评价方法的选择 5.1表1概述了用来定量生物材料支架表面或内部细胞活性的方法（但不限于这些方法）。需要注意 的是，这些方法常需要联合应用以确定活性细胞和无活性细胞的总数量，另外，可进一步检测具有增殖 活性的细胞数量。增殖的细胞具有活性，但活性细胞不一定都增殖。即使无活性细胞结构不完整或不 能进行完整的新陈代谢行为，仍可以采用使染料通过破损的细胞质膜进人细胞的方法将无活性细胞鉴 定出来。 2 YY/T1562—2017 表1 细胞检测与评价方法 破坏性的（需要将细胞从 非破坏性的（检测时细胞 检测指标/检测方法 支架或基质上分离) 仍然在支架或基质上） I总细胞数目 DNA检测 x 结晶紫染色 II活细胞数目 代谢分析（ATP含量） X X 四唑盐试验：MTT,MTS,WST,XTT X X AlamarBlue染色 X 中性红染色 X 葡萄糖消耗试验 X 细胞增殖(DNA合成)分析： X 3H-胸腺嘧啶或者BrdU标记 染料排斥试验：台盼蓝，赤藓红，苯胺黑 流式细胞术分析 细胞自动计数仪分析 vuonge doc88- IⅢI活细胞/死细胞比率 根据质膜完整性利用双重荧光染料的活/列 死 X 检测 非荧光染料排除试验 X 流式细胞术分析 X IV成像 细胞密度、形态和空 组织切片观察 x 共聚焦显微镜观察 X X 扫描电子显微镜观察 X 磁共振成像观察 Micro-CT观察 X X 注：“×"表示可以适用。 5.2 细胞在三维构建物内的总数量，包括活性细胞和无活性细胞数量，一般可以通过DNA检测分析 （见6.1.1）来确定，测定方法见YY/T0606.25。 这些分析是在细胞被破坏性地从生物材料支架上分离 再被裂解后进行的，可以间接地确定细胞总数量。由于很多细胞与生物材料支架粘附较牢固，在细胞分 离过程中会对细胞造成破损或丢失。因此，简单通过人工计数完整染色细胞或未染色细胞并不可靠。 5.3 如果采用细胞悬液计数，可以采用YY/T0606.13的检测方法。 5.4 如果只确定活性细胞的数量，可以使用荧光或比色的新陈代谢指示剂，这些指示剂可根据细胞进 行新陈代谢活动时对生长培养基发生的化学还原反应产生荧光或者改变颜色。新陈代谢试验在生物材 料支架破坏和非破坏形式下都可以使用。 3