ICS 11.040.30 YY C 30 中华人民共和国医药行业标准 YY/T1434—2016 人类体外辅助生殖技术用 医疗器械体外鼠胚试验 Medical devices for human in vitro assisted reproductive technology- In vitro mouse embryo assay 2016-01-26发布 2017-01-01实施 国家食品药品监督管理总局 发布 YY/T1434—2016 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家食品药品监督管理总局提出。 本标准由中国食品药品检定研究院归口。 本标准起草单位：中国食品药品检定研究院、中国科学院遗传与发育生物学研究所。 本标准主要起草人：韩倩倩、冯晓明、戴建武、肖志峰、尹艳云、徐丽明、章娜。 - YY/T1434—2016 人类体外辅助生殖技术用 医疗器械体外鼠胚试验 1范围 本标准规定了体外鼠胚试验方法，适用于与配子和/或胚胎接触的人类体外辅助生殖技术用医疗器 械的安全性评价。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T16886.2医疗器械生物学评价第2部分：动物福利 GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品 YY/T0995一2015人类辅助生殖技术用医疗器械术语和定义 3 术语、定义和缩略语 3.1术语、定义 YY/T0995一2015界定的以及下列术语适用于本文件。 注：以下胚胎均指小鼠胚胎。 3.1.1 囊胚 blastocyst 受精卵经卵裂形成的具有囊胚腔的胚胎。 3.1.2 1-Cell Embryo 1-细胞胚胎 受精但尚未发生卵裂的合子。 3.1.3 2-细胞胚胎 2-Cell Embryo 完成第一次卵裂的含两个卵裂球的胚胎。 3.2缩略语 PMSG：孕马血清促性腺激素（pregnantmareserumgonadoirophin） hCG：人绒毛膜促性腺激素（humanchorionicgonadotrophin） 4 试验方法 4.1概述 本试验是采用小鼠胚胎体外常规培养体系，在从受精卵到囊胚的培养过程中，根据待检产品的功能 1 YY/T1434—2016 和特性，在相应培养环节使用待检液体类产品或者器具类产品的浸提液，通过观察早期胚胎从受精卵到 囊胚的发育情况来评价待检产品对胚胎发育的潜在毒性 体外鼠胚试验有1-细胞方法和2-细胞方法，无论使用1-细胞方法还是2-细胞方法进行鼠胚试验， 试验步骤都应当尽可能模拟该产品用于人类辅助生殖培养的操作程序。本试验需要在具备条件的洁净 实验室内进行。 注：推荐使用1-细胞胚胎方法。 4.2 试验材料 4.2.1试验动物 试验动物品系：选择敏感和稳定的品系。 试验动物周龄：雌鼠6周龄～8周龄，性成熟雄鼠。 动物福利应符合GB/T16886.2的要求。 注：有关试验动物品系的选择参见附录A，推荐使用B6D2F1等杂交一代小鼠。试验动物购买自有资质的试验动物 生产机构。 4.2.2试剂 PMSG。 a) b) hCG。 c) 适合的培养液，经鼠胚试验检测合格。 注：推荐使用M2培养液进行胚胎收集和冲洗，使用M16培养液进行供试品浸提液制备和胚胎培养。 (P 透明质酸酶：经鼠胚试验检测合格。 c) 培养用油：经鼠胚试验检测合格。 4.2.3 耗材 a) 冲胚针。 b) 显微镊。 c) 眼科剪。 (P 移卵装置。 e) 10μL、100L、1000μL移液器吸头。 f) 培养皿。 以上所用耗材需对胚胎无毒性。 4.2.4仪器 a) CO2培养箱 温度37℃0.3℃，相对湿度大于90%（饱和湿度），5%或6%CO2。或者三气培养箱 b) 体视和倒置显微镜 含37℃±0.5℃恒温装置。 4.3 试验过程 4.3.1样品准备 4.3.1.1 供试品准备 胚胎体外培养相关的液体类供试品，按照产品使用说明进行合理运输、保存和使用。试验过程中根 2 YY/T1434—2016 据产品的临床使用说明来准备供试品。人类辅助生殖器具类供试品按照GB/T16886.12的要求合理 浸提，浸提介质推荐使用M16培养液。 4.3.1.2对照组准备 a) 阳性对照组 所使用的阳性对照品应经方法学验证，证实其在规定的使用方法和使用剂量下能够产生有统计学 意义的胚胎毒性。 b）阴性对照组 阴性对照组使用M2、M16培养液。 注：试验中使用的所有与胚胎接触的培养液和耗材都应是已经通过鼠胚试验检测的产品， 4.3.2试验程序 4.3.2.1超数排卵 选择6周龄～8周龄雌鼠，经腹腔注射PMSG10IU/只；48h后经腹腔注射hCG10IU/只，注射 hCG当日雌鼠与同品系雄鼠合笼过夜 4.3.2.2准备培养血 培养胚胎前在细胞培养血中制备一定数量30μL～50L大小的液体微滴（培养液），表面覆盖培养 用油，在CO2培养箱内预平衡4h～18h。 4.3.2.3 鼠胚采集 合笼第二天早上检查交配情况，选择见栓小鼠备用。 a）1-细胞胚胎收集：注射hCG后18h～22h后处死见栓雌鼠，在输卵管壶腹部收集1-细胞胚胎 将收集到的絮状受精卵团放置到37℃提前预热好的透明质酸酶中，当胚胎周围的卵丘和颗粒 细胞被消化分离后立即转移、清洗后，挑选出正常形态的受精胚胎，转移到培养微滴中，用于1- 细胞鼠胚检测试验。 b) 2-细胞胚胎收集：注射hCG后40h～48h后，处死见栓雌鼠。用显微锻将输卵管末端（输卵管 伞）套上冲胚针，用培养液将胚胎从输卵管中冲洗出来，收集到的2-细胞胚胎经冲洗后用于2- 细胞鼠胚检测试验。 4.3.2.4体外培养 采用微滴法培养，将收集到的鼠胚随机分成一个阳性对照组、一个阴性对照组和一个供试品组，置 于已平衡的培养液（见4.3.2.2)中，于37℃，5%或6%CO2，饱和湿度的培养箱中培养。每组鼠胚数不 少于50个。 注1：每组试验鼠胚来自3只～5只小鼠，将每只孕鼠的胚胎随机分配到各试验组进行试验。建议每个微滴中不超 过20个胚胎。 注2：供试品准备、试验过程中供试品接触方式、供试品接触时间随供试品种类而各有不同，具体给样时间和方式参 照附录B。 4.3.3试验结果 1-细胞胚胎体外分别培养96h，或2-细胞72h后记录囊胚数量。 观察指标：囊胚形态观察。 可接受准则： 3