YY C30 中华人民共和国医药行业标准 YY/T0878.1—2013 医疗器械补体激活试验 第1部分：血清全补体激活 Test for complement activation of medical devices- Part 1:Serum whole complement activation 2013-10-21发布 2014-10-01实施 国家食品药品监督管理总局 发布 YY/T0878.1—2013 前 言 YY/T0878的总标题是《医疗器械补体激活试验》，包括以下部分： 第1部分：血清全补体激活； —第2部分：替代途径补体激活； 第3部分：经典途径补体激活。 有关其他方面的补体激活试验将有其他部分的标准。 本部分为YY/T0878的第1部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 YY/T0878的本部分参考ASTMF1984—1999《固体材料血清内全补体激活试验的标准规范》 制定。 本部分与ASTMF1984一1999相比，存在以下差异： —增加了前言部分； 一增加了附录A试剂和缓冲液制备。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家食品药品监督管理总局提出。 本部分由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会（SAC/TC248）归口。 本部分主要起草单位：国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心。 本部分参加起草单位：上海生物材料研究测试中心；中国医学科学院输血研究所。 本部分主要起草人：乔春霞、王科镭、刘成虎、丁婷婷、孙皎、王红。 I YY/T0878.1—2013 引言 GB/T16886.4中给出了医疗器械/材料血液相容性的试验方法以及试验的选择策略，但只给出了 选择原则。YY/T0878的本部分是体外全补体激活作用的具体试验方法，可作为GB/T16886.4中医 疗器械/材料补体激活试验的补充。 作为血液的重要组分，补体系统激活后产生的效应分子将直接影响医疗器械/材料的血液相容性。 补体不适当的激活可能会导致机体的严重急/慢性反应。YY/T0878的本部分所描述的体外全补体激 活作用的评定方法，可用来筛选医疗器械/材料是否具有潜在补体激活作用。 Ⅱ YY/T0878.1—2013 医疗器械补体激活试验 第1部分：血清全补体激活 1范围 YY/T0878的本部分给出了医疗器械体外全补体激活作用的试验方法，本方法适用于固态样品。 本部分未涉及单一补体成分的功能、修饰或消耗以及来源于血浆的补体。 注：非固态样品在使用本方法时，宜确定方法的适用性。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T16886.1E 医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验 GB/T16886.4医疗器械生物学评价第4部分：与血液相互作用试验选择 3术语和定义 GB/T16886.1、GB/T16886.4界定的术语和定义适用于本文件。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ab：抗体（溶血素） BBS:巴比妥缓冲液 BBS-G：巴比妥缓冲液-明胶 BBS-GM：巴比妥缓冲液-钙镁离子明胶 C：已激活补体 EDTA：乙二胺四乙酸二钠盐二水合物 HS:人血清 PVDF：聚偏氟乙稀 RBC:红细胞 5绵羊RBC的制备 5.1 将市售的绵羊红细胞（SRBC)保存在Alsever溶液中，4℃贮存。贮存超过8周或者目测检查第二 次清洗的上清液当中有血红蛋白时，将细胞废弃。 注：所有离心操作均在4℃条件下进行。除特别说明，所有的试剂、试管和细胞制剂均在冰上保存。 5.2将5mLSRBC在1000g下离心10min。 1 YY/T0878.1—2013 5.3将细胞沉淀悬浮于10mL冷BBS-G-EDTA中，37℃孵育10min。离心并使细胞沉淀重新悬浮于 10mL冷BBS-G-EDTA中。 5.4细胞离心后，将上清液废弃（首次清洗），并使细胞沉淀重悬于10mL冷BBS-GM中。重复进行两 次（共计3次清洗）。 5.5通过分光光度计或血液分析仪的测定，用冷的BBS-GM工作液调配得到10mL浓度为 1.5X10°个/mL的BBS-GMSRBC悬液（如用分光光度计进行调配，约1体积上步制备的细胞悬液加人 24体积BBS-GM工作液，在412nm波长下，光径为1.0cm，吸光度为0.56相当于1.5×108个/mL的 细胞浓度）。 5.6经过清洗、稀释的RBC冰上放置，至少可使用12h。 6血清（补体）的吸收 6.1宜使用人类补体，因为不同物种补体激活效能存在差异，而且试验材料将被应用于人体。人血清 作为补体源的一种，可从生物制品供应商处购买，并且一般标示为试剂级补体。 6.2为去除人血清中自然产生的抗SRBC溶血抗体，可采用SRBC吸附人血清异嗜抗体的方法，虽然 大多数情况下，如果细胞用溶血素进行最佳致敏，人血清中异嗜抗体的数量不足以影响两者之间的反 应。详细步骤见6.36.8。 6.3新鲜人血清或市售的人血清均在一70℃贮存。最好使用新鲜血清，因为冻干剂的补体活性一般 不如新鲜血清 6.4血清在冰上解冻，或用冷（4℃）的无内毒素的蒸馏水复溶（若为冻于剂） 6.5为避免本步骤中补体被激活，所有操作均在冰上进行，且试剂和细胞均冰冷处理，4C条件下以 1000g进行离心。 6.6按0.1mLRBC/2.5mL血清的比例，将冷血清与冷的、已清洗的压积绵羊RBC混合，水上孵育10 min后，4℃条 件下 000g离心10min.小心地将土清液转移到一个新的、冰上放置的容器中。 6.7重复6.6的步骤两次。 6.8将吸附后的人血清按0.5mL~1.0mL等分试样（便于一次试验使用）贮存在冷的、带锁扣盖的 微量离心试管内， 一70℃保存直到使用。等分试样宜在冰上解冻，且在解冻当日使用，并不宜再次 冷冻。 7最佳溶血素浓度的测定 7.1为了节省贵重试剂和避免前带效应，最佳溶血素的浓度测定是必要的。购买的市售抗绵羊RBC 的兔血清（溶血素）解冻后，或用无内毒素的蒸馏水复溶（若为冻干剂）后，在56℃条件下热灭活30min， 并等分成适宜体积，一70℃贮存直到使用。 7.2将$13mm×100mm一次性玻璃试管，放置在冰浴中的试管架上，加入0.1mL，浓度为1.5×108 细胞/mL的已清洗绵羊RBC。如需要对试验结果进行统计学分析，则每种条件下宜采用3支相同试 管。否则，两支甚至单只试管就足够了。仅向一组3支相同试管中加人0.1mL冷BBS-GM(无RBC对 照，作为补体背景颜色）。 7.3对盛有RBC的试管，向一组3支试管中分别加人1.1mL冷蒸馏水（完全裂解对照），向另一组中 加人0.1mLBBS-GM(无溶血素对照）,其余各组试管中分别加人0.1mL1：2系列稀释的溶血素（试 验）。推荐抗体稀释度在1：400与1：25600之间。向无RBC对照试管中再加人0.1mLBBS-GM。 7.4轻微摇动每支试管，快速混合重新悬浮细胞，将试管架放置在37℃水浴，孵育10min，然后再放回 到冰浴中。 2 YY/T0878.1—2013 7.5向两组加入抗体试管的一组中加入1.0mL冷BBS-GM（无补体对照）。除全部裂解对照组试管 外，向其余所有试管中加人0.5mL冷BBS-GM，然后再加人0.5mL稀释至1：100或1：200的吸附过 的人血清（补体）。 注：对于特定量的人血清，1：100或1：200稀释度宜提供足够的补体活性。同时，无溶血素（只有补体）对照组中 的裂解百分率宜不超过10%。若1：100稀释度的补体中的裂解百分率超过10%，则采用1：200的稀释度。 若无溶血素对照组仍超过10%时，则需要用不同量的血清进行试验。 7.6手工摇动试管悬浮细胞，然后将试管架放置在37℃的水浴中孵育1h，间歇性摇动试管，使细胞保 持在悬浮状态。 7.71h后，将试管架置于冰上。然后将冷的试管在4℃条件下1000g离心10min，将上清液轻轻移 人相应编号的13×100mm玻璃试管中。 7.8在412nm波长处测量上清液的吸光度。每支试验管和对照管的裂解百分率的计算是用其在 412nm处的吸光度减去无RBC对照的吸光度（指3支相同试管的平均值，然后除以完全裂解对照值 （指3支相同试管的平均值），再乘以100%，见式（1)。 X100% ........(1) 全部裂解吸光度 7.10绘制特异性裂解百分率与对应的溶血素浓度倒数的滴定曲线。在滴定曲线的平稳段取刚进人 平台区溶血素浓度的两倍浓度值，用于随后的致敏RBC测定（最佳溶血素浓度）。每次使用前将贮存的 溶血素重新稀释。 8全补体滴定测定最佳血清稀释度 8.1若需要对结果进行统计学分析：则在每种条件下，宜用3支13×100mm的一次性玻璃试管对全 部条件重复测定3次。否则，两支甚至单支试管就足够了，试管提前进行编号，条件包括完全裂解、无 补体（无C）带有和不带有溶血素的试验组（稀释人血清-HS）以及无RBC（使用最高浓度血清的补体 所有试剂、试管和操作均在冰冷条件下，试管架上的试管放置于冰浆中。 背景颜色对照。 8.2除无RBC的试管以外，将清洗过的RBC加入所有试管中(0.1mL/管的15×10°细胞/mL悬浮 液）。无RBC试管中加人0.1mL冷缓冲液。 8.3向完全裂解试管中加人1.1mL蒸馏水。向无C"的试管中和带有溶血素的试验管中加入0.1mL 最佳浓度的溶血素（见7.10）向无RBC试管中加入0.1m