ICS 11.040.01 YY C 30 中华人民共和国医药行业标准 YY/T0870.5—2014 医疗器械遗传毒性试验 第5部分：哺乳动物 骨髓染色体畸变试验 Test for genotoxicity of medical devices- Part5:Mammalianbonemarrow chromosome aberration test 2014-06-17发布 2015-07-01实施 国家食品药品监督管理总局 发布 YY/T0870.5—2014 前言 YY/T0870的总标题是《医疗器械遗传毒性试验》，包括以下部分： 第1部分：细菌回复突变试验； 第2部分：体外哺乳动物染色体畸变试验； 第3部分：用小鼠淋巴瘤细胞进行的体外哺乳动物细胞基因突变试验； 第4部分：哺乳动物骨髓红细胞微核试验； 第5部分：哺乳动物骨髓染色体畸变试验。 本部分为YY/T0870的第5部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分是参考OECD475：1997《哺乳动物骨髓染色体畸变试验》并结合医疗器械/材料自身特点制 定的。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家食品药品监督管理总局提出。 本部分由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会（SAC/TC248)归口。 本部分参加起草单位：国家食品药品监督管理局北大医疗器械质量监督检验中心、四川医疗器械生 物材料和制品检验中心。 本部分主要起草人：尹玉霞、黄经春、李春令、韩建民、梁洁。 I YY/T0870.5—2014 引言 GB/T16886.3中给出的检测潜在遗传毒性物质的试验方法均为经济合作与发展组织（OECD)《化 学品测试指南》中规定的方法，但这些方法是针对化学品的特性制定而成，同时未给出详细的试验步骤， 因此不适宜直接用于医疗器械/材料的检测。YY/T0870的本部分参照OECD试验方法基本原则，并 根据医疗器械/材料的特性对试验方法进行了适当的修改，规定了详细的试验步骤，可作为 GB/T16886.3中遗传毒性试验的补充方法标准。 YY/T0870的本部分参照OECD475：1997方法，用细胞中期分裂相阻断剂（如秋水仙素和秋水仙 胺)对实验动物进行处理，通过对处于有丝分裂中期的动物骨髓细胞的染色体畸变情况进行分析.以评 价试验样品潜在的致突变性 YY/T0870的本部分用于检测受试物诱发的动物（通常为啮齿类动物）骨髓细胞的染色体畸变 染色体畸变可分为结构畸变和数目畸变两种。其中，结构畸变可分为染色体型和染色单体型。大多数 化学致突变物诱导染色单体型突变，但染色体型突变也可发生。YY/T0870的本部分不适用于检测数 目畸变。 YY/T0870的本部分常规使用啮齿类动物。骨髓是靶组织，因为它富含血管，且有大量易于分离 和处理的快速循环的细胞。如果有证据表明受试物或其活性代谢产物不能到达靶组织，则YY/T0870 的本部分不适用。 Ⅱ YY/T0870.5—2014 医疗器械遗传毒性试验 第5部分：哺乳动物 骨髓染色体畸变试验 1范围 YY/TC870的本部分规定了医疗器械/材料哺乳动物骨髓染色体畸变试验方法， 注：口腔材料的确乳动物细胞染色体畸变试验不包括在YY/T0870本部分范围内。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件、 GB/T16886.1 医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验 GB/T16886.2E 医疗器械生物学评价第2部分：动物福利要求 医疗器械生物学评价第3部分：遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验 GB/T16886.3 GB/T16886.11 医疗器械生物学评价第11部分：全身毒性试验 GB/T16886.12 医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品 YY/T0870.22013 3医疗器械遗传毒性试验第2部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 3术语和定义 GB/T16886.1、GB/T16886.3、GB/T16886.12和YY/T0870.2—2013界定的术语和定义适用千 本文件。 4主要设备 压力蒸汽灭菌器、光学显微镜、离心机、恒温水浴箱和解剖器械等。 5试剂 试剂按YY/T0870.2一2013附录B中规定的方法制备或购买市售商品。 6 实验动物 6.1总则 所有的动物试验应在经国家认可机构批准并符合全部适用实验室动物福利法规的实验室内进行， 并且还应符合GB/T16886.2的要求。 1 YY/T0870.5—2014 6.2动物选择 推荐使用健康、初成年的中国仓鼠、大鼠或小鼠。如果已经证实某品系动物对引起染色体结构或数 目畸变的供试物检测有足够的敏感性，则此种动物可以选用。每组实验动物数量至少为10只，雌雄各 半。试验开始时，每种性别实验动物间体重差异宜最小且不超过平均体重的土20%。 注：宜根据器械的预期用途，调整实验动物的性别比例， 7样品制备 宜根据GB/T16886.12的原则制备试验液，使用适宜的极性和/或非极性溶剂作为浸提介质。若 使用未知的浸提介质，应提供其相容性 。如怀疑试验样品可能对实验动物产生毒性体征或导致有 丝分裂指数降低时，应进行预试验 注1：ISO10993-3正在修订，当新的样品制备方法在未来标准中得到确认后即可采所 注2：与经典的化学物全身毒性试验不同，医用材料一般得不到LDs。的剂量值。若采用浸提液进行试验，可考虑单 剂量组试验（即试验样品原液或100%的浸提原液），但宜对试验所采用的剂量范围提供相应的支持性数据。 8对照样品制备 8.1阴性对照：同批号试验样品的浸 个质， 武验 条件 8.2阳性对照：阳1性对照组预期在体内产生 变应高 底值。 形 宜的阳性对照剂量以得到 阳性结果。如可能，宜考虑利用与受请 武物化学结构相关的 性对照（ 表1) 阳性对照物示例 化学物名称 CAS 三亚乙基密胺（triethylenemelamine) [51-18-3] 甲磺酸乙酯（ethylmethanesuphonate) 52-50- 乙基亚硝基腺（ethylnitrosourea） [.759-73-9] 丝裂霉素C(mitomycinC) 50-07-7J 环磷酰胺一水合物（cyclophosphamide,monohydrate） [59-18-0 (6055-19-2)] 9试验步骤 9.1预试验 如怀疑试验样品可能对实验动物产生毒性时，应进行预试验。宜至少设置3个剂量水平，覆盖毒性 从最大到小或无毒性。高剂量组应达到不产生动物死亡的最高剂量。最高剂量是指产生毒性体征的剂 量，高于该剂量即有可能引起动物死亡。最高剂量也可规定为引起骨髓毒性指标的剂量（如有丝分裂指 数降低50%以上）。用于确定剂量范围的预试验，步骤应与正式试验相同。 9.2动物处理 宜根据实验动物的大小来确定一次性最大给液量。推荐按GB/T16886.11中给出的剂量分别对 各组实验动物进行腹腔注射或尾静脉注射。对照组采用相同的处理方式，推荐阳性对照组环磷酰胺的 2 YY/T0870.5—2014 注射剂量为50mg/kg。由于供试物的吸收、代谢时间及其对细胞周期动力学的作用都可能影响染色体 畸变的最佳检测时间，因此，宜根据细胞周期和不同物质的作用特点，可先做预试，确定取样时间。通常 采用两个时间点采样法，第一次采样在末次注射后12h～18h，即相当于1.5倍细胞周期的时间。第二 次采样时间在第一次采样后24h。 动物在处死前，腹腔注射适量的细胞中期分裂相阻断剂（如秋水仙素）.然后间隔适宜时间采集骨髓 细胞并分析染色体畸变情况 注：秋水仙素推荐剂量为4mg/kg体重，试验时可视具体情况做适当调整。 9.3骨髓细胞制备 9.3.1低渗 以人道方式处死学 实验动物后，立即从股骨或胸骨采集骨髓细胞，分散细胞并用适当生理溶液 5mL~7mL，用滴管将细胞轻轻地吹打混匀，放入37℃水浴中低渗处理lgmin20min，加入1mL～ 用醇；水醋酸3：1)混匀。以1500r/min离心5min，弃去 2mL固定液 上清液。 9.3.2 固定 加入 5mL 7mL固定液，混 离心5min，弃去上清液。 同法再固定1~ 2次，弃去 9.3.3 滴片 在骨髓细胞中加人数滴新鲜固 夜滴于 冻的载玻 上，自然干燥。 液， 9.3.4 染色 将滴片用吉姆萨（Gfemsa）应用液染色，晾干备 9.3.5 阅片 先在低倍镜下选择染色体分散良好的中期分裂相细胞，然后在油镜下观察并记录染色体畸变情况。 10结果观察 各剂量组（包括阳性对照组和阴性对照组）的每只动物至少分析1000个细胞测定有丝分裂指数， 以确定细胞毒性。有丝分裂指数应在各试验室历史数据范围之内。 每只动物应至少分析100个分散良好的中期分裂相细胞（染色体数为2n士2），如畸变率很高，观察 的细胞数可减少。应记录每一观察细胞的染色体数目，对于畸变细胞还应记录畸变类型。所有的标本 片包括阳性对照和阴性对照，在显微镜分析之前应独立编号。 11 推荐的观察项目 11.1染色体数目的改变 11.1.1 非整倍体：亚二倍体或超二倍体。 11.1.2 多倍体：染色体成倍增加。 11.1.3 核内复制：核膜内的特殊形式的多倍化现象。 3 YY/T0870.5—2014 11.2染色体结构的改变 11.2.1 断裂：损伤长度大于染色体的宽度。 11.2.2 微小体：较断片小而呈圆形。 11.2.3 有着丝点环：