ICS 11.040.40 YY C 45 中华人民共和国医药行业标准 YY/T0606.20-2014 组织工程医疗产品 第20部分：评价基质及支架免疫反应的 试验方法：细胞迁移试验 Tissue engineered medical products- Part 20:Standard practice for evaluation of immune responses of substrate and scaffoldproducts :Cellmigration tests 2014-06-17发布 2015-07-01实施 国家食品药品监督管理总局 发布 YY/T0606.20—2014 前言 YY/T0606标准的总题目为《组织工程医疗产品》已经或计划发布以下部分： 第2部分：术语； 第3部分：通用分类； 第4部分：皮肤替代品（物）的术语和分类； 第5部分：基质及支架的性能和测试； 第6部分：1型胶原蛋白； 第7部分：壳聚糖； 第8部分：海藻酸钠； 第9部分：透明质酸钠； 一第10部分：修复或再生关节软骨的植人物的体内评价； 第12部分：细胞、组织、器官的加工处理指南； 第13部分：细胞自动计数法； 第14部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法：ELISA法； 第15部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法：淋巴细胞增殖试验； 第16部分：保存指南； 第17部分：外源性因子评价指南； 第18部分：海藻酸盐凝胶固定或微發化指南； 第19部分：修复和替代骨组织植人物骨形成活性的体内评价指南； -第20部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法：细胞迁移试验； 第24部分：可吸收生物材料植人试验评价规范； 第25部分：动物源性生物材料DNA残留量测定法：荧光染色法； 第26部分：聚合物支架微结构评价指南。 本部分为YY/T0606的第20部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家食品药品监督管理总局提出。 本部分由中国食品药品检定研究院归口。 本部分起草单位：第三军医大学第一附属医院全军烧伤研究所、中国食品药品检定研究院。 本部分由中国食品药品检定研究院解释。 本部分主要起草人：彭代智、方玉、周灵、章娜、刘敬、冯晓明。 I YY/T0606.202014 组织工程医疗产品 第20部分：评价基质及支架免疫反应的 试验方法：细胞迁移试验 1范围 YY/T0606的本部分规定了评价组织工程医疗产品基质或支架所致哺乳动物细胞免疫反应的试 验方法：细胞迁移试验。 本部分适用于组织工程医疗产品基质或支架的生物学评价。 注：本部分所述试验虽然也可以用于人体标本的检测或用于研究目的，并可为临床追踪提供数据，但并非对人体状 况的诊断性检测。 除本部分所选方法外，可采纳其他等效方法。 并非所有的材料和应用均需要按照本部分进行检测，因此应仔细考虑本部分中方法的适用性。在 实施本部分推荐的试验前，应考GB/T16886.1或管理部门所推荐的试验结果所提示的信息。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T16886.1 医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验 GB/T16886.6E 医疗器械生物学评价第6部分：植人后局部反应试验 GB/T16886.10医疗器械生物学评价第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验 GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品 YY/T0606.3组织工程医疗产品第3部分：通用分类 YY/T0606.5组织工程医疗产品第5部分：基质及支架的性能和测试 ISO/TS10993-20医疗器械生物学评价第20部分：医疗器械免疫毒理学试验原则和方法（Bio- logical evaluation of medical devicesPart 20:Principles andmethodsforimmunotoxicologytestingof medical devices) 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 基质substrate 组织工程医疗产品中作为细胞或生物分子生长、支持或输送载体的原材料。 3.2 支架scaffold 促进替代、修复或再生组织的细胞或生物活性因子迁移、结合或输送的支持物、释放载体或基体。 1 YY/T0606.20—2014 3.3 细胞迁移 cellmigration 细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的浓度梯度后而产生的移动。在这一过程中，细胞不断 重复着向前方伸出突足，然后牵拉胞体的循环过程。 3.4 趋化性chemotaxis 本文中仅限于免疫学概念。细胞由于环境中某些化学物质的存在而表现出的定向移动特性。 3.5 白细胞趋化性leukocytechemotaxis 白细胞对免疫反应产物的一种反应，白细胞被吸引和聚集在反应部位。 3.6 趋化因子chemokine 一类结构相似，具有白细胞趋化性的低分子量蛋白，为细胞因子超家族成员。 3.7 CD3分子CD3molecule 由、8、e、和n等几种多肽链组成的六聚体，并与T细胞识别抗原受体形成TCR/CD3复合物，共 同完成抗原信号向T细胞内传递的功能。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ConA：伴刀豆球蛋白A（concanavalinA) PBS：磷酸盐缓冲盐溶液（phosphatebufferedsaline) PBMC，外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells) PHA：植物凝集素(phytohaemagglutinin) PMNC：多形核白细胞（polymorphonuclearcell) 5细胞迁移试验 5.1原理 受相应抗原刺激的致敏淋巴细胞能释放出多种淋巴细胞趋化因子，从而增强淋巴细胞的细胞迁移 功能。在体外培养条件下淋巴细胞的移动情况，代表了淋巴细胞受刺激后释放的多种趋化因子的总体 效应，可用于判断淋巴细胞是否被活化，从而反映机体对某一抗原的特异性细胞免疫水平。 本试验所用的淋巴细胞来源于人或兔的外周血，或小鼠的脾脏。PBMC或脾脏淋巴细胞既可作为 本试验淋巴细胞趋化因子的产生细胞，也可作为本试验淋巴细胞趋化因子的效应指示细胞。 5.2材料和标本的选择 基质/支架（以下统称为材料）或其中的已知成分，以及依据GB/T16886.12制备的材料浸提液均 可作为免疫学实验材料。这些材料、成分或浸提液既可以用于体内试验，也可以用于体外试验。 注；当采用材料浸提液作为免疫学实验材料时应对浸提条件的有效性进行论证。 用于细胞迁移试验检测的标本可以来自于依据GB/T16886.6和GB/T16886.10进行的刺激及致 敏试验或植人试验的动物血液、器官和组织或活检标本，也可采用相应的临床追踪的患者血液和活检标 本。亦可以用各种抗原免疫动物（免或小鼠）获得的标本。 2 YY/T0606.20—2014 5.3抗原的制备 5.3.1阳性对照 可以CD3e单克隆抗体、PHA或ConA作为阳性对照。采用RPMI-1640配制，推荐的浓度范围为 CD3e单克隆抗体（2.5μg/mL~20μg/mL）、PHA（2.5μg/mL20μg/mL）、ConA（2.5μg/mL~ 20μg/mL)。制备好的阳性刺激剂可储存在冰箱中备用。其有效期各异，但一般可保存数月。在进行 本试验前，应检查刺激剂的纯度和活性。 5.3.2阴性对照 推荐以生理盐水或PBS或浸提介质作为阴性对照。 5.3.3实验样本的制备 可根据样本的实际情况，采用组织工程医疗产品基质或支架或其中的已知成分，或材料浸提液。当 采用材料浸提液作为免疫学实验材料时应对浸提条件的有效性进行验证。 5.4淋巴细胞的制备 5.4.1PBMC的制备 无菌条件下，抽取5mL外周血，以肝素钠或肝素锂抗凝。将等体积PBS稀释的抗凝血缓慢沿试管 壁加在5mL淋巴细胞分离液上，使形成清楚的界面。稀释血液与淋巴细胞分离液体积比例约为2：1。 室温下，400g水平离心20min～25min。此时可见离心管中形成5层，从上向下依次为血浆层、单 个核细胞层（此层呈白色雾状，含淋巴细胞和单核细胞）、淋巴细胞分离液层、粒细胞层（呈白色膜状）以 及最下面的红细胞层。 吸除最上面的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液层交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC 到新的离心管中。 加入10mL预冷的PBS洗涤PBMC，200g室温下离心5min。弃上清，并尽量去除残留的淋巴细 胞分离液。 用预冷的含10%小牛血清的RPMI-1640培养液重悬PBMC沉淀，并行细胞计数和细胞活力测定， 调整细胞浓度为4×10°个/mL（用于趋化因子样本制备）或5×10°个/mL（用于淋巴细胞迁移试验）。 5.4.2脾脏淋巴细胞的制备 取一只纯系小鼠，采用断颈椎法处死，置于75%的酒精中浸泡消毒5min。无菌条件下剖腹取出脾 脏，放人盛有5mLPBS的平皿中。 将脾脏放在不锈钢网上，置于平血中，用试管底一边研磨脾脏，一边均匀缓慢地滴加PBS冲洗，以 至完全研碎组织，用吸管吹打混匀，制成单细胞悬液。 将单细胞悬液用尼龙膜[孔径为75μm（200目）]过滤，200g室温下离心5min，弃上清。 加人红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，静置约1min～3min，200g室温下离心5min，弃上清。PBS 洗一次，200g室温下离心5min，