ICS 11.060.10 YY C 33 中华人民共和国医药行业标准 YY/T0127.17—2014 口腔医疗器械生物学评价 第17部分： 小鼠淋巴瘤细胞（TK)基因突变试验 Biological evaluation of medical devices used in dentistry- Part 17: Mouse lymphoma cells (TK) gene mutation test 2015-07-01实施 2014-06-17发布 国家食品药品监督管理总局 发布 YY/T0127.17—2014 前言 本部分是《口腔医疗器械生物学评价》系列标准中的一部分标准。 1单元：评价与试验》是口腔医疗器械生物学评价与试验项目的选择，为指南性标准。 -YY/T0127是口腔医疗器械具体生物试验方法标准，其中YY/T0127共分为以下部分： —YY/T0127.1口腔材料生物试验方法溶血试验； -YY/T0127.2口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法急性全身毒性试验：静脉 途径； YY/T0127.3 ：口腔医疗器械生物学评价第3部分：根管内应用试验； -YY/T0127.4 4口腔医疗器械生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法骨埋植试验； 口腔医疗器械生物学评价第5部分：吸入毒性试验； —YY/T0127.5 YY/T0127.6 口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法显性致死试验； -YY/T0127.7 口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法牙髓牙本质应用 试验； -YY/T0127.8 口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法皮下植人试验； -YY/T0127.9 9口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法细胞毒性试验：琼 脂覆盖法及分子滤过法； -YY/T0127.10口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法鼠伤寒沙门氏杆菌回复突 变试验（Ames试验）； —YY/T0127.11牙科学用于口腔的医疗器械生物相容性临床前评价第2单元：口腔材料 试验方法盖髓试验； ——YY/T0127.12牙科学口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法微核试验； -YY/T0127.13口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法口腔黏膜刺激试验； -YY/T0127.14口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法急性经口全身毒性试验； -YY/T0127.15口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法亚急性和亚慢性全身毒性 试验：经口途径； —YY/T0127.16 口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法哺乳动物细胞体外染色体 畸变试验； 一YY/T0127.17口腔医疗器械生物学评价第17部分：小鼠淋巴瘤细胞（TK)基因突变 试验。 本部分为YY/T0127的第17部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不应承担识别这些专利的责任。 本部分主要参照GB/T16886.32008（ISO10993.3：2003）中推荐的OECDGUIDLINEFOR THETESTINGOFCHEMICALS“InVitroMammalianCellGeneMutationTest”476:1997方法 制定。 本部分由国家食品药品监督管理总局提出。 本部分由全国口腔材料和器械设备标准化技术委员会（SAC/TC99)归口。 1 YY/T0127.17—2014 本部分起草单位：四川医疗器械生物材料和制品检验中心（四川大学）、国家食品药品监督管理局北 大医疗器械质量监督检验中心、上海生物材料研究测试中心、深圳市医疗器械检测中心。 本部分主要起草人：梁洁、袁、张金、孙姣、曹苹、林红、李秋、朱蔚精、陆华、刘尧。 YY/T0127.17—2014 口腔医疗器械生物学评价 第17部分： 小鼠淋巴瘤细胞（TK）基因突变试验 1范围 YY/T0127的本部分规定了口腔医疗器械小鼠淋巴瘤细胞（TK)基因突变试验方法，包括操作步 骤、数据处理和结果判定。 本部分适用于测定口腔医疗器械的致突变性。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T16886.1 医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验 GB/T16886.3E 医疗器械生物学评价第3部分：遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验 GB/T16886.12 医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品 3术语和定义 GB/T16886.1、GB/T16886.3和GB/T16886.12界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 突变频率mutantfrequency 观察到的突变细胞数除以存活细胞数。 3.2 相对总生长relativetotalgrowth 处理组随时间延长细胞的增长与阴性对照组的细胞增长数之比，计算为相对悬浮生长与相对存活 率的乘积。 3.3 相对悬浮生长 relativesuspensiongrowth 表达期末处理组与阴性对照组的细胞增长数之比。 3.4 活力viability 表达期后平板培养时处理组细胞集落形成效率。 3.5 相对存活率relativesurvival;RS 处理期末平板培养时处理细胞的集落形成效率。通常用处理组与阴性对照组细胞活力的相对数 表示。 1 YY/T0127.17—2014 4仪器及试剂 4.1实验室常用设备 倒置相差显微镜，细胞计数器，洁净工作台，CO，恒温培养箱，恒温水浴箱，移液器，低温高速离心 机，低温冰箱（低于一80℃)或液氮罐等。 4.2培养基、试剂及耗材 4.2.1生长培养基：DMEM、RPMI1640培养基或其他合适的培养基，加10%灭活马血清、100U/mL 青霉素及100μg/mL链霉素。 4.2.2THMG培养基：RPMI1640培养基，加10%马血清、3μg/mL的胸苷、5μg/mL的次黄嘌、 0.1μg/mL的氨甲蝶呤和7.5μg/mL的甘氨酸。 4.2.3THG培养基：不含氨甲蝶呤的THMG培养基。 4.2.4 集落培养基：RPMI1640培养基，加青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL.加 20%灭活马血清。 4.2.5阳性对照物：甲基磺酸甲酯（MMS，以含1%DMSO的无血清培养基配制）、环磷酰胺(CPA，以无 血清培养基配制）、苯并[a]花、3-甲基胆葱、 4.2.6 pH 7.2 磷酸盐缓冲液:称取 NaCI 8.5 g、KCI0.2 g、NazHPO,:12H,Q 2.85 g(或 N NazHPO,: 2H,O1.13g）KH,PO.0.27g,溶于1000mL蒸馏水中,用pH计测定并调节至pH7.2。 高压灭菌， 冷却后冷藏保存。 4.2.7 细胞培养血，96孔细胞培养板 离心管等 5样品制备 5.1试样制备 5.1.1按产品说明书制备试样。按GB/T16886.12的原则制备试验液或浸提液。 注：固化类材料应考志固化后放置时间对试验结果的影响。 5.1.2溶剂或浸提介质可选用水、生理盐水、无血清培养基等。 5.1.3适当时，应使用两种适宜的浸提介质，一种是极性溶剂，另一种是非极性溶剂或适合于医疗器械 性质和使用的液体，两种溶剂均应与试验系统相容。 注：常用的非极性溶剂，如浓度不大于1%的DMSO等。 5.2对照 阴性对照：同批号受试物的溶剂或浸提介质。 5.2.1 5.2.2阳性对照：无活化系统可选择甲基磺酸甲酯（MMS，以含1%DMSO的无血清培养基配制）、甲磺 酸乙酯（EMS）、丝裂霉素C（MMC)；有活化系统可选择环磷酰胺（CPA，以无血清培养基配制）、苯并[a 、3-甲基胆葱等。 注1：阴性和阳性对照都应与受试物相同的试验条件下制备。 注2：必要时还应设置空白对照。 6试验方法 6.1细胞系 6.1.1细胞系 本部分使用L5178Ytk+/-3.7.2C小鼠淋巴瘤细胞。 2 YY/T0127.17—2014 6.1.2细胞自发突变清除 每次试验前应适时检查细胞的自发突变频率。当细胞突变频率偏高时，按下列步骤对自发突变细 胞进行清除： a）将对数生长的细胞配制成2X105个/mL，加人100倍的THMG液，加人量为总体积的1%。 置CO2培养箱（含体积分数5%CO2，下同）培养24h； b）培养24h后以200g离心5min，除去上清液，加人新鲜RPMI1640培养液，细胞密度调整为 2×105个/mL。加入100倍的THG液，加人量为总体积的1%。培养45h～48h，注意避免 过度培养； 将培养后的细胞以200g离心5min，弃去上清液，加人新鲜培养基配制成5×104个/mL～ 10×10*个/mL的细胞悬液，培养24h后，取少量细胞，测定PE和SMF； d) 将清除自发突变的细胞扩增后分装于冻存管中冻存。 6.2体外代谢活化系统 小鼠淋巴瘤基因突变试验应在有和无代谢活化系统的条件下，使细胞与试验物质接触。本部分使 用的代谢活化系统为大鼠肝S9加辅助因子（制备方法参见YY/T0127.10） 6.3染毒剂量（细胞与受试物接触） 6.3.1 在细胞与受试物接触时,应考虑受试物对细胞毒性的影 宜根据细胞毒性与预试验的相对存 响 活率进行剂量设计，一般在相对存活率为阴性对照组的 120%~80%范围内设高、中、低三个剂量组。组 一个值,按等比级数分组。 量组应无细胞毒性或略有细胞毒性。或者，对 距可选择 10之间的 低剂 2 于有毒性的材料，最高剂量可选