ICS 65.020 LY B 61 中华人民共和国林业行业标准 LY/T 2756—2016 白蜡品种分子鉴定方法一 SRAP分子标记法 Molecularidentificationmethodforfraxinus varietieswith SRAP (sequence-relatedamplifiedpolymorphism)molecularmarkers 2016-10-19发布 2017-01-01实施 国家林业局 发布 中华人民共和国林业 行业标准 白蜡品种分子鉴定方法- SRAP分子标记法 LY/T2756—2016 * 中国标准出版社出版发行 北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029) 北京市西城区三里河北街16号（100045) 网址www.spc.net.cn 总编室：(010)68533533发行中心：(010)51780238 读者服务部：(010)68523946 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 各地新华书店经销 开本880×1230 1/16 印张1 字数26千字 2019年2月第一版 2019年2月第一次印刷 * 书号：155066·2-33049 定价18.00元 如有印装差错 由本社发行中心调换 版权专有侵权必究 举报电话：(010)68510107 LY/T2756—2016 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由辽宁省林业厅提出。 本标准由国家林业局归口。 本标准起草单位：辽宁省林业科学研究院、沈阳农业大学、锦州市林业科学研究所。 本标准主要起草人：陈罡、范俊岗、魏忠平、叶景丰、马冬菁、郭志富、刘平、刘怡菲、孟凡金、潘文利、 丽、冯健、刘红民、王骞春、高英旭、杨鹤、田永霞、王琴、刘薇、伊宏峰、金山、赵丽辉。 I LY/T2756—2016 白蜡品种分子鉴定方法 SRAP分子标记法 1范围 本标准规定了白蜡品种分子鉴定方法一SRAP分子标记法的操作程序和分析方法。 本标准适用于利用相关序列扩增多态性（SRAP)法对白蜡品种（种）鉴定的实验过程。 2 2原理 通过设计一对引物对白蜡基因组DNA进行扩增。正向引物（F-primer)含有17个碱基，对外显子 进行特异扩增；反向引物(R-primer)含有18个碱基，对内含子区域、启动子区域进行扩增。因个体不同 以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不同而产生多态性。最终通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将 这些特异的多态性片段分离开来，通过比较待测样品和对照品种DNA指纹谱带数据的差异，来判断待 测样品与对照品种是否为相同品种。 3术语和定义 3 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 相关序列多态性 sequence-related amplified polymorphism; SRAP 利用一对引物对ORFs(openreadingframes，开放阅读框）进行扩增，一对引物包括正向引物和反 向引物，因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔序列长度不等而产生多态性。 4 仪器和设备 4.1 PCR扩增仪。 4.2 琼脂糖凝胶电泳系统。 4.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳系统。 4.4 凝胶成像系统和照相系统。 4.5 超纯水系统。 4.6 低温高速冷冻离心机。 4.7 超微量紫外/可见分光光度计。 4.8 高压灭菌锅。 4.9 液氮罐。 4.10 超低温冰箱。 4.11 高压电泳仪（3000V稳压）及配套电泳槽。 4.12 移液器（枪）。 1 LY/T2756—2016 5引物 引物相关信息见附录A。 6试剂与溶液 6.1主要常规试剂见附录B。 6.2非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂见附录C。 6.34 银染试剂见附录D。 7 操作程序 7.1 鉴定材料 选用不同品种（种）白蜡树新鲜叶片为材料提取基因组DNA。选取适量样品，装入冻存管，液氮速 冻，置于超低温冰箱中，一70℃保存备用。 7.2DNA的提取 7.2.1采用CTAB法提取白蜡基因组DNA。将干净研钵、研杆、小匙、无水乙醇预先放入冰箱中 一20℃预冷，用自来水、蒸馏水先后冲洗叶面，再用滤纸吸干水分。 预热过（60℃）的CTAB提取液、5μL0.2%β-巯基乙醇和5μLRNaseA（10mg/mL），充分混匀后放人 65℃水浴30min。其间每隔10min轻轻摇动混匀2次3次。 7.2.3取出离心管加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1)，轻轻颠倒混匀10min，再于台式冷冻离心机上 12000r/min离心10min。 7.2.4将上清液转人另一新的1.5mL离心管中，重复步骤7.2.31次～2次。 匀，使DNA沉淀成絮状，一20℃放置30min以上。 7.2.6用钩状玻璃棒轻轻挑出絮状沉淀并置于新的1.5mL离心管中。如果样品未出现云雾状沉淀或 看不清沉淀，10000r/min离心10min，再收集沉淀。 7.2.7加人1mL~1.5mL70%无水乙醇浸泡洗涤沉淀，轻摇几分钟，10000r/min离心10min，收集 沉淀，重复1次。然后将离心管水平放置在清洁场所晾干或在超净工作台上吹干。 7.2.8风干后加人100μL灭菌的TE缓冲液溶解沉淀。 7.3DNA浓度的检测和定量 用TE缓冲液配制1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、7.5μg/mL和10μg/mL的入-DNA分子量标 准溶液，各取3μL入-DNA分子量标准溶液和3μL步骤7.2中提取的未知浓度DNA溶液，在0.8%琼 脂糖凝胶上电泳15min～20min，稳压90V，电泳缓冲液为1×TBE，325nm紫外灯下观察，照相，通过 与标准溶液的荧光进行比较估测未知DNA的浓度。 将步骤7.2中提取的DNA溶液取10μL后，在1.5mL离心管中用TE缓冲液稀释200倍，然后放 入石英比色杯中，用紫外分光光度计检测，记下其在260nm和280nm的光密度值（OD值），按式（1)计 算出DNA的浓度及OD260和OD280的比值。OD260/OD280应在1.8～2.0之间。 2 LY/T2756—2016 D=OD260XnX50/1000 ....(1) 式中： D DNA的浓度，单位为纳克每微升（ng/μL）； OD260— 260nm下的光密度值； n 稀释倍数。 7.4PCR反应 7.4.1PCR反应体系 在冰盘或4℃条件下进行操作。25μL反应总体系中，含有10×PCR缓冲液2.5mmol/L， Mg2+2.5mmol/L，dNTPs0.25mmol/L，正向、反向引物各0.4μmol/L，TaqDNA聚合酶0.5U，模板 DNA40ng/μL。 7.4.2PCR反应程序 扩增程序首先是94℃预变性5min；然后前5个循环为：94℃变性1min，37℃复性1min，72℃ 延伸1min；随后的35个循环为：94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1min；最后72℃延伸 8min，4℃保存。 7.4.3PCR产物的处理 PCR扩增反应结束后，在25μL的反应体系中加人5μL的上样缓冲液，摇晃混匀后，备用。聚丙 烯酰胺凝胶的制备。 7.5聚丙烯酰胺凝胶的制备 7.5.1玻璃板的清洗 用洗涤剂清洗玻璃板（长板和短板），自来水冲洗干净，随后将玻璃板用蒸馏水冲洗2次，再用无屑 纸巾沾取无水乙醇擦拭2遍，置于通风橱内垂直晾干待用。 7.5.2胶槽装配 7.5.2.1玻璃板的固定 将长板玻璃板平铺于通风橱内，边条擦拭干净后置于长板玻璃板两侧，随后用短板玻璃板整齐地压 盖住，确认边条与两玻璃板均对齐后，将其放人封胶框中并用夹子固定在制胶板上。 7.5.2.2封胶 配制1%的琼脂糖凝胶，煮沸后用胶头滴管吸取，沿底边从左至右缓缓灌注入封胶框中，避免出现 气泡，待琼脂糖凝胶完全漫过玻璃板底部，停止灌注，待其室温凝固后再进行下一步操作。 7.5.3丙烯酰胺胶的配制 （TEMED），迅速轻轻混匀。 7.5.4灌胶 固定有封好玻璃板的制胶板向后倾斜放置，将配好的8%非变性聚丙烯酰胺工作液沿玻璃板壁缓 3 LY/T2756—2016 凝固30min以上。 7.5.5上样和电泳 待凝胶完全凝固后，将装有凝胶的玻璃板轻轻从制胶板上取下，灌胶口向内用夹子固定在电泳槽 上，使用1×TBE缓冲溶液灌注电泳仪的上下两槽，使下槽溶液漫过封胶框，上槽溶液漫过灌胶孔。垂 直缓慢将梳子从灌胶口中拨出，并用1×TBE缓冲溶液清洗和整理样品槽。使用200&L移液器从左至 右逐个对点样孔进行吹打，直至点样孔内无碎胶、气泡以及其他杂质。取5μL步骤7.4.3处理后的 PCR扩增产物上样，并在胶板的一侧或适当位置的点样孔中加人4μL的DNAMarker (DL2000Marker)作为对照，电泳在200V稳压，电流100mA条件下进行，电泳时间约为1.5h～2h （参见附录E)。 7.5.6卸胶 电泳结束，关闭电源，将上槽中1XTBE缓冲液放出，取下固定的夹子，去掉下部琼脂糖，取下玻璃 板。将玻璃板水平放置，用起胶铲沿灌胶口一侧边缘将玻璃板缓慢撬起，将紧贴有凝胶的玻璃板放入装 有双蒸水的洗胶盘中轻轻摇晃，待凝胶与玻璃板完全分离后，取出玻璃板，放净双蒸水。 7.6银染 7.6.1固定 将取出的凝胶小心放入装有1L新配制的10%冰乙酸（固定/终止液)的塑料方盒中，水平摇床上 80r/min轻摇10min。 7.6.2漂洗 将凝胶小心转人双蒸水中漂洗2次，每次1min，倒净双蒸水。 7.6.3染色 在新配好的500mL硝酸银溶液中加入1.6mL37%甲醛溶液，充分混匀后沿一角倒入装有凝胶的 方盒中，水平摇床上80r/min避光轻摇30min，然后放净染色液。 7.6