SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2641—2010 食品中常见致病菌检测 PCR-DHPLC 法 Detection of pathogen in food- PCR-DHPLC method 行业标准信息服务平台 2010-11-01发布 2011-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2641—2010 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准主要起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检 技发展有限公司。 本标准主要起草人：曹际娟、郑秋月、徐君怡、黄晓蓉、耿丽梅、孙哲平、王旭、于畅、邵碧英、郑晶、 杨春华、王振国、高晓博。 行业标准信息服务平台 SN/T 2641—2010 食品中常见致病菌检测 PCR-DHPLC法 1范围 本标准规定了食品中沙门氏菌等30种致病菌的PCR-DHPLC检测方法。 本标准适用于食品中沙门氏菌等30种致病菌的快速检测。 注：30种常见致病菌包括：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏 菌、空肠弯曲菌、嗜热弯曲菌、肠出血性大肠埃希氏菌O157：H7、产肠毒素大肠埃希氏菌、肠致病性大肠埃希氏 菌、肠侵装性大肠埃希氏菌、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、 梅氏弧菌、嗜水气单胞菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、蜡样芽孢杆菌、溶血性链球菌、布鲁氏杆菌、乳酸杆菌、绿脓 杆菌、肺炎克雷伯氏菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 行业标准 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA（deoxyribonuleicacid）：脱氧核糖核酸 dNTP（deoxyribonucleosidetriphosphate）：脱氧核苷酸三磷酸 服务平台 DHPLC（denaturinghighperformanceliquidchromatography）：变性高效液相色谱 PCR（polymerasechainreaction）：聚合酶链式反应 Taq（Thermusaquaticu）：水生栖热菌 TEAA：三乙基铵醋酸盐 4生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置。应按 照GB19489中的有关规定执行。 5废弃物处理和防止污染的措施 5.1检测过程中的废弃物需经121℃高压灭菌处理至少30min后再弃置。 5.2检测过程中防止交叉污染的措施参照标准GB/T27403执行。 1 SN/T 2641—2010 6原理 DHPLC分析技术是应用离子对反相液相色谱原理对DNA片段进行分离。离子对采用三乙基胺 醋酸盐缓冲溶液（TEAA），核苷酸片段分子中带负电荷的磷酸根基团与TEAA分子中带正电荷的氨基 发生静电作用相互吸引，同时TEAA分子中的三个乙基与固定相C18表面的烷基发生疏水作用力而相 互吸引，通过流动相中的乙睛的梯度洗脱达到将不同大小的核苷酸片段分离。 7试剂和材料 除另有规定外，所有试剂纯度应为色谱纯。水为灭菌超纯水，符合GB/T6682中一级水的规格 所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装 7.1TaqDNA聚合酶。 7.2dNTP:dATP,dTTP,dCTP,dGTP。 7.4 引物：引物序列见附录表A.1。 7.5 TE溶液。 7.6 10% SDS。 7.7 蛋白酶K(20mg/mL）。 7. 8 氯化钠（NaCl)：5mol/L和0.7mol/L。 7. 9 10% CTAB。 7. 10 三氯甲烷。 7. 11 异戊醇。 7. 12 酚。 7.13异丙醇。 7.1470%乙醇。 7.15DHPLC缓冲液：缓冲溶液A为50mLTEAA和250uL乙混合，加水定容至1000mL；缓冲 信息服务平台 8 主要仪器和设备 8.1 PCR仪。 8.2 DHPLC 仪。 8.3高速离心机：离心转速18000g。 8.4PCR超净工作台。 8.5微量可调移液器和灭菌吸头：2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL。 8.6灭菌PCR反应管。 9方法提要与检测程序 9.1方法提要 本方法利用DHPLC非变性条件下的DNA分离技术，灵敏地检测PCR扩增产物进行细菌鉴定分 析，不同的细菌显示特异的DHPLC吸收峰，从而对食品中的致病菌进行快速检测。 2