SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4705—2016 化学品 蜜蜂幼虫单次暴露毒性试验 Chemicals-Honey bee larval toxicity test,single exposure 2016-12-12发布 2017-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4705—2016 前言 本标准按照GB/T1.1一2009的规则起草。 本标准与联合国经济合作与发展组织（OECD)化学品测试方法NO.237（2013)《蜜蜂幼虫单次暴露 毒性试验》（英文版）有关技术内容一致，是OECD成年蜜蜂测试导则213和214的补充，可视为化学品 蜜蜂整体风险评估方案中的一种低层次试验。 本标准做了下列结构和编辑性修改： 删除了引言； —增加了“范围”一章； 一将各章节重新编号； 一删除了参考文献部分。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局 本标准主要起草人：刘汉伟、陈丹超、谭曜、孙运、李冰、陈威威、李锦花、 I SN/T4705—2016 化学品 品蜜蜂幼虫单次暴露毒性试验 1范围 本标准规定了化学品蜜蜂幼虫单次暴露毒性试验的方法。 本标准适用于测试化学品（尤其是具有杀虫活性的成分或制剂)对蜜蜂幼虫的单次暴露毒性。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 剂量dose 受试物的使用量（μg)，用单只蜜蜂幼虫所用受试物的质量（μg/只幼虫)来表达。 2.2 半数致死量 LD50 染毒后导致50%实验生物死亡的受试物统计学数量。本试验半数致死量以单个密蜂幼虫所用受 试物的质量（μg/只幼虫）来表达。 S 2.3 死亡率 mortality 死亡的受试生物占总受试生物的比率 3试验准备 3.1 供试生物 3.1.1 供试生物来源 来源于三个蜂群的蜜蜂幼虫（Apismeltifera），每一个蜂群的幼虫作为一个重复组。蜂群需有充足 的饲料供应，健康且尽可能没有感染疾病和寄生虫，有详细的来源及生理状况记录。 3.1.2 供试生物卫生处理 如对蜂群进行了螨虫或疾病等卫生处理，则应在报告中注明处理日期和所用产品相关信息。试验 开始前四周内不得进行卫生处理。 3.1.3供试生物获取 试验前第3天(D-3)用隔离笼（内含一个空蜂窝或一个有正在孵化的工蜂和空巢室的蜂窝）将至少 三个蜂群的蜂王分别隔离在各自的蜂群内（图1)，隔离笼紧靠装有蜂卵的蜂巢。蜂王在试验前第2天 （D-2)产新卵之后放出，蜂王关在隔离笼内时间不得超过30h，应减少隔离时间以保障幼虫间的体型和 年龄差异最小化。装有蜂卵的蜂巢在试验第1天(D-1)前均应放置在隔离笼内。 1 SN/T 4705—2016 含幼虫的蜂房 隔离笼 子脾 图1内置一个隔离笼的蜂箱横截面 3.2试验设备 3.2.1聚苯乙烯等化学情性材料制成的小仓室（内径为9mm，深度为8mm，如图2），鼓风干燥箱，多 孔板（48孔），密闭透明塑料容器，恒温培养箱。 3.2.2小仓室使用前应消毒处理，可先将小仓室浸没于乙醇或其他消毒溶液中30min，然后在鼓风干 箱中干燥。干燥后的小仓室放入48孔板中，顶端应与48孔板保持在同一个水平，可在48孔板底部放 置一个用500μL消毒溶液及15%（质量浓度）甘油润湿的牙科棉卷（图2）来保持高度。 幼虫十食物 转移仓 孔 经500uμL消毒液及15%（质量浓度） 甘油润湿的牙科棉卷 图2置于培养孔内的幼虫小仓室 3.2.3试验时将48孔板放置在密闭透明塑料容器中，容器内放置一个装有硫酸钾（KSO,）饱和溶液的 培养皿使空气湿度达到饱和。 3.3饲料 3.3.1 根据幼虫不同发育阶段的需求，饲料分为三种： 饲料A（第1天）：50%新鲜蜂王浆+50%水溶液（内含2%酵母提取物、12%葡萄糖和12% 果糖)。 b） 饲料B（第3天）：50%新鲜蜂王浆+50%水溶液（内含3%酵母提取物、15%葡萄糖和15% 果糖)。 2 SN/T4705—2016 c）饲料C(第4天到第6天）：50%新鲜蜂王浆+50%水溶液（内含4%酵母提取物、18%葡萄糖和 18%果糖）。 3.3.2 2糖溶液中各组分完全溶解后，再与蜂王浆混合。“新鲜蜂王浆”是指12个月内采集的蜂王浆；在 放人冷冻箱（≤一10℃）保存前，可先分成5g一份，以避免每次试验前都需解冻整批蜂王浆。商业来 源的蜂王浆，若使用效果符合要求（如幼虫期的死亡率不超过15%），则亦可以使用。推荐对每批蜂王 浆进行分析，以证实其不含污染物（主要是抗生素和杀虫剂）。 3.3.3试验期间的饲料应存放于0℃～5℃的冰箱内（但不冷冻）。也可提前准备好并深度冷冻，使用 前解冻。 3.4受试物溶液配制 3.4.1通常使用去离子水作为溶剂配制受试物储备溶液，当受试物溶解性较差时，可使用有机溶剂（如 丙酮）来配制。应尽可能减少有机溶剂使用量，若使用丙酮，则不得超过染毒当天（试验第4天）最终饲 料体积的5%。 3.4.2优先使用去离子水（溶解性差的物质可用其他溶剂）将储备溶液稀释成5个浓度梯度的试验溶 液。受试物若溶于水中，则测试溶液的体积不得超过最终饲料体积的10%；若溶于丙酮，则不应超 过5%。 3.4.3应在≤一10℃的冷冻箱内保存一份储备溶液，用于受试物浓度分析。 3.5参比物 3.5.1 试验应使用分析纯乐果（CASRN.60-51-5)作为参比物进行质量控制。 3.5.2 乐果以8.8ug/只土0.5ug/只幼虫的剂量溶解于3μL水中，试验第4天给幼虫喂食前与饲料 混匀。 4试验程序 4.1 试验方法概述 试验第1天从三个蜂群的蜂巢中取出同步化的一龄幼虫装入小仓室，再分别将小仓室转移至48孔 板中，饲喂标准份量的人工饲料。试验第4天染毒：在饲料中以5个递增的浓度梯度添加单一剂量的受 试物，观察并记录第5天、第6天和第7天幼虫死亡率，并计算72hLDs0。 4.2试验组和对照组 试验单元为载有一只幼虫的独立小仓室。至少从三个蜂群中各取不少于12只幼虫放人同一块 48孔板中，用于受试物的一个处理水平或对照组或参比物组试验。每个试验应包含下列处理和空白 对照： 一含有机溶剂（若使用）的空白对照（至少12只幼虫×3个蜂群=36只幼虫）； 一5个受试物浓度组（每个浓度含至少12只幼虫×3个蜂群=36只幼虫每种处理），浓度几何级 数不超过3，浓度范围应包含LDso值；当进行限度试验时（详见4.4限度试验），受试物浓度为 100μg/只幼虫或受试物在试验溶液中的最大溶解度（二者中选浓度低者）； 一参比物，8.8ug乐果/只幼虫（至少12只幼虫×3个蜂群=36只幼虫）。 4.3预实验 为了确定受试物LDso范围，可选择以5～10倍几何比率变化的受试物剂量进行预试验。例如： 3 SN/T4705—2016 0.1μg/只幼虫、1μg/只幼虫、10μg/只幼虫、100μg/只幼虫。 4.4限度试验 在受试物的预计毒性较低或溶解性较差时，可选择100μg受试物/只幼虫或受试物在试验溶液中 的最大溶解度（二者中选浓度低者）进行限度试验，以证明LDso大于此浓度。限度试验应设置受试物处 理组、空白对照组、有机溶剂对照组（若使用）和参比物组，幼虫分别从三个蜂群中各取至少十二只作为 三个重复。试验结束时，如果与空白对照组相比有显著死亡率发生，则需进行全面试验。 4.5幼虫的收集 4.5.1试验第1天，将装有幼虫的蜂窝从蜂箱中取出（图1)），放人绝热容器内转移到实验室超净台或其 他洁净环境中，并保持室温不低于20℃。为避免幼虫间的差异对试验结果的影响，推荐选择新孵化的 尚未形成“C”形状的幼虫，并随机放人多孔板中。为保障在第4天喂食受试物时每个蜂群（一共三个蜂 群）至少有十二只幼虫，通常在试验第1天使用超过这个数量的幼虫 4.5.2也可在第4天喂食前将同一块48孔板上的幼虫进行随机排列。一次试验约需要7～8块多 孔板。 4.6 幼虫转移和喂食 4.6.1幼虫转移时使用的48孔板应提前预热至34℃~35℃，但不可 超过35℃。饲喂前应先将饲料 在恒温箱中预热，再使用配有一次性枪头的微型移液管喂食。试验第1天，先在每个小仓室内放人 20uL饲料A，再在饲料表面放入用转移工 具或湿润的画刷从蜂窝中取出的幼虫。幼虫转人48孔板后， 再将48孔板转至恒温培养箱的密闭容器中，恒温培养箱应保持通风且箱内温度在试验期间尽可能保持 在34℃～35℃范围内。 4.6.2幼虫除第2天外每天喂食 次（如图3），喂食应在一个不超过35℃的温暖环境下进行。应将饲 料沿着小仓室内壁放在幼虫旁边 ，避免接触或淹没幼虫，喂食的饲料体积需每天进行校准。即使小仓室 内剩有未被消耗的饲料，仍应继续加入额定的新饲料。 试验结束时若有未被吃完的饲料，应予以记录。 C+ 饲料 试验 c c 游液 饲料体积 40 50 （μL/只幼虫） D3 D2 D1 DO D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 产卵 孵化 幼虫喂食期 34~35℃，95%相对湿度 早晨： 将蜂王放入 转移一龄幼虫 试验结束 隔离笼 下午： 将蜂王放出 在蜂箱内 在实验室 图3幼虫毒性试验流程图 SN/T4705—2016 4.7 单次暴露 试验第4天从每个蜂群中选取至少十二只饲喂良好的幼虫，饲喂30μL含受试物溶液的饲料C。 应在第4天临喂食前将试验溶液与饲料混匀，除非有数据证明受试物在饲料中的稳定性。 4.8 3试验条件 试验期间将48孔板置于恒温培养箱中黑暗条件下培养，温度保持在34℃～35℃间，允许温度出 现一定程度的偏离，但不可低于23℃或高于40℃，