SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1221—2016 代替SN/T1221—2003 鸡传染性支气管炎检疫技术规范 Quarantineprotocolfor chickeninfectious bronchitis 2016-03-09发布 2016-10-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T1221—2016 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替SN/T1221一2003《鸡传染性支气管炎抗体检测方法 琼脂免疫扩散试验》。 本标准与SN/T1221一2003相比，主要技术变化如下： 修改了中英文名称； 删除了缩略语（见2003年版第3章）； 增加了概述（第3章）； 增加了鸡传染性支气管炎病毒分离与鉴定（4.2）； 增加了反转录-聚合酶链式反应（4.3)； 增加了微量血凝试验（4.4.3）； 增加了微量血凝抑制试验（4.4.4）； 增加了酶联免疫吸附试验（4.5）； 增加了气管环组织培养血清中和试验（4.6）。 本标准参考OIE《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》（2013)第2.3.2章节《禽传染性支气管炎》。 请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不应承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民 共和国江西出人境检验检疫局、阿拉山口出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：孙洁、杨春华、陈兵、林庆燕、徐军、秦智锋、陶虹、卢体康、曾少灵、刘建利、 唐金明、廖立珊、阮周曦、杨俊兴、曹福、张彩虹、吕建强、花群义、陈书琨、胡运发。 本标准所代替的标准的历次版本发布情况为： SN/T1221—2003。 SN/T1221—2016 鸡传染性支气管炎检疫技术规范 1范围 本标准规定了鸡传染性支气管炎的临床症状与病理变化、病毒的分离与培养、反转录-聚合酶链式 反应、微量血凝试验和微量血凝抑制试验、酶联免疫吸附试验、气管环组织培养和血清中和试验检测 方法。 本标准适用于进出境鸡传染性支气管炎的诊断和检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 GB/T23197鸡传染性支气管炎诊断技术 SN/T2123出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范 3概述 鸡传染性支气管炎（Chickeninfectiousbronchitis，IB）是一种急性、高度接触性传染病，通常会引起 生长期禽类呼吸道症状，母鸡产蛋率下降。病原体为鸡传染性支气管炎病毒（Chickeninfectiousbron chitisvirus，IBV），属于冠状病毒科冠状病毒属。该病于1930年首次在美国北达科他州首先发现，呈世 界性分布，可以感染各种年龄的鸡，传播方式分为空气传播、直接接触传播和机械传播。 4诊断技术 4.1临床综合诊断 4.1.1临床症状 传染性支气管炎临床主要感染鸡.通常是肉鸡、蛋鸡等：其待征性症状为喘息、咳嗽、打喷嚏、气管 罗音和流鼻涕，偶尔出现窦肿胀。病鸡群精神沉郁，拥挤在热源下，饲料消耗和增重显著下降。传染性 支气管炎病毒能够在呼吸道、肠道、肾脏和输卵管中复制。大部分表现为呼吸道型，通过吸入感染后导 致呼吸道的损伤：输卵管感染型可以引起雏鸡输卵管的永久损伤，感染成年母鸡则会引起产蛋停止或者 产薄壳蛋、畸形蛋和粗糙蛋。肾型鸡传染性支气管炎会引起急性肾炎、尿结石导致死亡。康复后会遗留 慢性间质性肾炎，最终仍会导致死亡。 4.1.2病理变化 病鸡的气管、鼻道和窦中有浆液性、卡他性或干酪样的渗出物，气囊可呈现混浊或含有黄色干酪样 I SN/T1221—2016 渗出物。在死亡维鸡的气管后段或支气管中可见到干酪样的栓子，在大的支气管中周围可见到小的肺 炎区。肾病变型感染使肾脏苍白、肿大，肾小管和输尿管因尿酸盐沉积而扩张。 4.2病毒分离与鉴定 4.2.1总则 样品的采集、保存及运输应符合GB/T18088和SN/T2123的相关要求。 4.2.2样品的采集和处理 4.2.1.1鼻咽拭子 将灭菌的棉拭子插入鼻腔、喉头，轻轻擦拭3次～5次并慢慢旋转，然后取出拭子并放人盛有2mL 含青霉素10000IU/mL和链霉素10mg/mL的0.01mol/LpH7.2PBS（配制方法见附录A）离心管 内，加盖。 4.2.2.2组织 采集新鲜的肾脏、输卵管、气管、肺脏组织约3.0g~4.0g，放置于无菌平皿中。 4.2.2.3 血清或血浆 用无菌注射器直接吸取至无菌1.5mL离心管中。 4.2.3样品的保存和运输 所有样品应迅速低温保存，保证冷链运输。 4.2.4样品制备 拭子样品于旋涡振荡器上振荡混匀约5s后，于离心机中瞬时离心待用。 血清或血浆样品于台式冷冻离心机上3000g，冷冻离心5min后取上清待用。 组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品2.0g于研钵中充分研磨，再加10mL含青霉素 10000IU/mL和链霉素10mg/mL的0.01mol/LpH7.2PBS，混匀；或置于组织浆器中，加人含青 霉素10000IU/mL和链霉素10mg/mL的0.01mol/LpH7.2PBS匀浆。然后将组织悬液转人无菌 1.5mL离心管中3000g，4℃离心15min，取上清液转入另一无菌1.5mL离心管中，编号备用。 4.2.5接种鸡胚 组织样品及拭子样品按照4.2.4进行处理，用0.22μm滤膜过滤。取0.1mL0.2mL过滤液，经 尿囊腔接种9日～11日龄SPF鸡胚，石蜡封孔。37℃孵育箱中孵化。每天检查鸡胚，弃去24h内死亡 的鸡胚，48h～72h后收获尿囊液。观察鸡胚胚体病理变化。必要时取尿囊液盲传，至少盲传四代。 4.2.6结果判定 在阳性对照和阴性对照都成立的情况下，尿囊腔接种连续传三代后，出现特征性胚矮小病变，胚蜷 成球形，脚变形压在头上，肾小管出现尿酸盐沉着，可初步判为可疑。如未能引起典型的鸡胚病变、死亡 或纤毛运动停止，至少盲传四代才能判为阴性。 对于结果判定为可疑的样品，需进一步进行确证。 2 SN/T1221—2016 4.3反转录-聚合酶链式反应 4.3.1试剂 4.3.1.1除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T6682的要求。 4.3.1.2检测引物序列为：上游引物：5-TGA-AAA-CTG-AAC-AAA-AGA-3，下游引物：5'-CNG TRT-TRT-AYT-GRC-A-3。 4.3.2实验操作 4.3.2.1核酸抽提 4.3.2.1.1 用于核酸抽提的被检样本包括各种病料、用于IB监测和检测的组织处理样品，处理方法同 4.2.4，IBV的细胞培养液、IBV接种鸡胚的尿囊液等。 4.3.2.1.2取灭菌的1.5mL离心管，做好标识。 4.3.2.1.3每管加人600μLTrizol,分别加人4.3.2.1.1中制备的样本、阴性对照（SPF鸡胚尿囊液）、阳 性对照（标准的IBV毒株）各200μL，再加人200μL氯仿，混匀器上振荡混匀5s，于4℃12000g离心 15min。 4.3.2.1.4取无RNA酶的1.5mL离心管，加人400μL于一20℃预冷的异丙醇，吸取4.3.2.1.3各管中 的上清液400μL转移至相应的管中，避免吸出中间层，颠倒混匀。 4.3.2.1.5于4℃12000g离心15min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。 4.3.2.1.6 加人600μL一20℃预冷的75%乙醇，洗涤，于4℃12000g离心10min，弃上清。 4.3.2.1.7 重复步骤4.3.2.1.6，倒置于吸水纸上，沾干液体。 4.3.2.1.8 10000g离心10s，用微量加样器将其吸干，室温干燥5min~10min。 4.3.2.1.9加人15μL无RNA酶的水，溶解RNA，5000g离心5s，冰上保存备用。若需长期保存须 放置一20℃冰箱。 100倍核酸稀释液作为三个被检样本进行分子生物学检测。 4.3.2.2反应液的配制 正反应液配制区进行。按照商业化的一步法RT-PCR试剂盒推荐说明书，按附录B进行IBVRT PCR反应液的配制。将以上配制的每个PCR反应试剂充分混匀，转移至样本处理区。 4.3.2.3加样 在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加人已提取好的核酸2μL，盖上管盖，将PCR管放 人PCR检测仪内，记录样本放置顺序。 4.3.2.4PCR扩增 在扩增检测区进行。反应条件：反转录42℃，45min；94℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃， 30s，40个循环；延伸72℃，10min；4℃保存。 4.3.2.5核酸电泳 按附录B配制凝胶。将所有的样品按编号加人到对应的1.8%琼脂糖凝胶的各孔中，其中一孔为 标准阳性对照，一孔为标准阴性对照。在凝胶的边孔中加人标准分子量的DNAMarker。调节电压为 约5V/cm电泳约25min。将凝胶置紫外灯或凝胶成像仪中进行检查。 3