ICS 07.100.99 SN B15/19 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2622—2019 代替SN/T2622—2010 柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Xanthomonas citri subsp. citri Gabriel et al.(1989) 业标准信息服务平台 2019-09-03发布 2020-03-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T 2622—2019 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则编写。 本标准代替SN/T2622—2010《柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法》，与SN/T2622—2010相比主要变化 如下： 对原标准柑桔溃疡病菌检疫鉴定判定程序进行了修订； 补充了柑桔溃疡病菌图片资料； 补充了柑桔溃疡病菌荧光实时PCR检测方法等更多可选择的PCR方法； 补充了柑桔溃疡病菌致病性测定反应。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国成都海关、中华人民共和国上海海关 本标准代替标准的历次发布版本为： SN/T 2622—2010。 业标准信息服务平台 SN/T2622—2019 柑溃疡病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了进出境植物检疫中柑桔溃疡病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于进出境芸香科（Rutaceae)植物及其果实中柑桔溃疡病菌的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682实验室用水规格和试验方法 SN/T1157进出境植物苗木检疫规程 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 3病菌的基本信息 文本为准 柑桔溃疡病菌Xanthomonascitrisubsp.citriGabrieletal.（1989），属细菌域Bacteria，变形菌门 Proteobacteria，-变形细菌纲Gammaproteobacteria，黄单胞菌目Xanthomonadales，黄单胞杆菌科 Xanthomonadaceae，黄单胞菌属Xanthomonas，该病菌的其它信息参见附录A。 4方法原理 该病菌的为害症状、菌落形态特性、致病性反应、PCR特异性反应是其检疫鉴定的主要依据。 53 主要试剂 除另有说明，本标准中试剂均为分析纯或生化试剂，试验用水参照GB/T6682 70%乙醇、蛋白陈、牛肉浸膏、酵母膏、蔗糖、琼脂、溴化乙锭（EB）、琼脂糖、DNAMarker、TaqDNA 聚合酶、PCR体系、MgCl2、dNTP、TaqMan探针等。 6仪器设备 体式显微镜、超挣工作台、高压灭菌锅、生物培养箱、电子天平、普通冰箱、超低温冰箱、离心机、涡旋 混匀仪、纯水仪、浊度计、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、微量可调加样器、剪刀、培 养皿、三角瓶。 7检疫鉴定 7.1检疫鉴定流程 柑桔溃疡病菌鉴定流程如图1所示。 1 SN/T 2622—2019 显症样品 无症样品 阴性 喷菌观察 阳性 平板分离 PCR检测 阴性 典型菌落 无典型菌落 PCR检测 阴性 致病性测定 检出Xcc 未检出Xcc 图 1柑桔溃疡病菌鉴定流程 以正 7.2症状检查 按照SN/T1157和SN/T2122中规定的程序进行现场检疫并抽取样品。实验室对样品进行症状 检查，观察待检样品是否带有疑似症状（参见附录A），如有症状，切取症状处组织在显微镜下观察是否 有喷菌现象，如有喷菌，直接从喷菌组织分离病菌。 如样品无症或有症样品未见喷菌，进行PCR初检，PCR方法见附录B。PCR结果为阳性的样品再 进行病菌分离。 7.3PCR检测 取无症样品或未见喷菌的有症样品，灭菌生理盐水室温浸泡处理30min或4℃冰箱过夜，震荡，取 浸泡液10000r/min离心10min，沉淀提取DNA。常规PCR或实时荧光PCR检测（附录B)，柑桔溃 疡病菌DNA作为阳性对照，非柑桔溃疡病菌DNA作为阴性对照，双蒸水作为空白对照。 7.4病菌分离 有症样品症状处切取2mm×2mm小块组织，制片后于显微镜10×～20×倍下观察切口处是否 有云雾状细菌从切口处喷出。每个样品切取5～10个小块组织观察喷菌，分离其中有喷菌的3～5个小 2