ICS 67.160.10 QB 分类号：X62 备案号：60688-2017 中华人民共和国轻工行业标准 QB/T5197—2017 葡萄酒中12种游离氨基酸的测定 高效液相色谱法 Determination of 12 kinds of free amino acids in wines-High performance liquid chromatography 2017-11-07发布 2018-04-01实施 中华人民共和国工业和信息化部 发布 QB/T 5197-2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由由中国轻工业联合会提出。 本标准由全国食品发酵标准化中心归口。 本标准起草单位：中国食品发酵工业研究院、宜宾市产品质量监督检验所、深圳中检联检测公司、 天津科技大学、中国长城葡萄酒有限公司。 本标准主要起草人：钟其顶、陈黎、陈鹏飞、杜丽平、商华、高红波、李国辉。 本标准为首次发布。 - QB/T5197-2017 葡萄酒中12种游离氨基酸的测定高效液相色谱法 1范围 本标准规定了丹磺酰氯柱前衍生高效液相色谱测定葡萄酒中12种游离氨基酸的方法。 本标准适用于葡萄酒中精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、脯氨 酸(Pro)、-氨基丁酸（Gaba）、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸 (Phe)共12种游离氨基酸的测定。 本标准方法的检出限（mg/L）分别为：精氨酸，0.38；丝氨酸，0.35；苏氨酸，0.48；甘氨酸，0.26； 丙氨酸，0.36；脯氨酸，0.28；-氨基丁酸，0.40；缬氨酸，0.56；异亮氨酸，0.45；亮氨酸，0.40；色 氨酸，0.60；苯丙氨酸，0.40。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 采用丹磺酰氯衍生剂与葡萄酒中游离氨基酸进行衍生反应，氨基酸衍生产物具有荧光特性，经色谱 柱分离后，荧光检测器检测，外标法定量。 4试剂 除另有说明外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1乙腈（色谱纯）。 4.2无水碳酸钠。 4.3碳酸氢钠。 4.4磷酸二氢钠（二水化物）。 4.5磷酸氢二钠（十二水化物）。 4.6浓磷酸（85%，质量分数）。 4.7甲胺盐酸盐。 4.8N,N-二甲基甲酰胺。 4.9丹磺酰氯（纯度≥98%）。 4.10浓盐酸。 4.11氨基酸标准品（纯度≥98%）：具体名称参见附录A。 盐酸溶液（0.1mol/L）：吸取0.90mL浓盐酸（4.10）至100mL容量瓶中，用水定容，混匀。 4.12磷酸水溶液（10%，体积分数）：吸取10mL浓磷酸（4.6）至100mL容量瓶中，用水定容，混 匀。 4.13碳酸钠-碳酸氢钠溶液（0.08mol/L，pH9.5）：分别称取0.256g无水碳酸钠（4.2）和1.141g碳 酸氢钠（4.3）用水溶解并定容至200mL容量瓶中，混匀。 4.14丹磺酰氯溶液（6g/L）：称取0.060g丹磺酰氯（4.9），用乙腈（4.1）溶解并定容至10mL容 量瓶中，混匀，现配现用。 1 QB/T5197-2017 4.15盐酸甲胺溶液（20g/L）：称取0.2g甲胺盐酸盐（4.7），用水溶解并定容至10mL容量瓶中， 混匀。 4.16氨基酸标准储备液（500mg/L）：准确称取0.050g各氨基酸标准品（4.11），用0.1mol/L盐酸 溶液（4.12）溶解并定容至100mL容量瓶中，混匀。0℃~4℃冰箱保存，有效期3个月，或经国家认 证并授予标准物质证书的氨基酸标准物质。 4.17氨基酸混合系列标准作液：准确量取氨基酸标准储备液（4.17），用水逐级稀释，依次配制成 0mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、50.0mg/L的系列氨基酸混合标准工作液，现配现用。 5仪器和材料 5.1高效液相色谱仪：配有荧光检测器。 5.2天平：感量为0.1mg g和0.01g。 5.3涡旋混合器。 5.4恒温水浴锅。 5.5有机系微孔滤膜：孔径不大于 0.45μm 6 分析步骤 6.1 样品衍生 吸取0.5mL葡萄酒样品于10mL容量瓶中，用水定容，混匀。吸取1mL稀释后的葡萄酒样于带 塞试管中，加入1mL/碳酸钠-碳酸氢钠溶液（4.14）、1mL丹磺酰氯溶液（4.15），涡旋混匀。置于恒温 水浴锅中60℃避光衍生2h，然后加入0.1mL盐酸甲胺溶液（4.16）混匀，60℃避光衍生15min。取 反应完成的溶液，经0.45μum有机系滤膜过滤，滤液用于液相色谱测定。 6.2标准工作液衍生 分别移取1.0mL氨基酸混合系列标准工作液（4.18），置于带塞试管中， 按6.1方法进行衍生。 6.3参考色谱条件 6.3.1色谱柱：C18色谱柱（250mmx4.6mm，5um）或等效色谱村 6.3.2流动相A：分别称取0.98g磷酸二氢钠（4.4）和1.15g磷酸氢二钠（4.5）用适量的水溶解，加 入40mLN,N-二甲基甲酰胺（4.8），用水定容至1000mL，用磷酸水溶液（4.13）调 节pH至5.8，有 机系微孔滤膜过滤，滤液超声30min流动相B：乙腈（4.1） 6.3.3流量：1.0mL/min 6.3.4进样体积：10μL。 6.3.5柱温：30℃。 6.3.6荧光检测波长：激发波长为320nm；发射波长为523nm 6.3.7 洗脱梯度见表1。 表1梯度洗脱程序表 时间/min A/%（体积分数） B/%（体积分数） 0 86 14 5 80 20 10 75 25 19 75 25 2 QB/T51972017 表1 (续) A/%（体积分数） B/%（体积分数） 时间/min 50 35 50 70 37 30 70 47 14 48 86 58 14 86 6.4定性分析 根据各氨基酸标准品的保留时间，与待测样品中组分的保留时间进行定性，定性色谱图参见附录B。 6.5外标法定量 以氨基酸混合系列标准工作液（4.18）中各氨基酸浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工 作曲线。将经6.1和6.2制备的待测液注入于高效液相色谱仪，测定待测液中各氨基酸色谱峰面积，由标 准工作曲线计算样品中的各氨基酸浓度。 6.6结果计算 样品中各氨基酸的含量按公式（1）计算： X,=c,xn. (1) 式中： Xi 样品中各氨基酸的含量，单位为毫克每升（mg/L） 从标准曲线求得待测液中氨基酸的含量，单位为毫克每升（mg/L）； ci 样品稀释倍数 测定结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留至小数点后1位。 6.7精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10 0% 3 QB/T5197-2017 附录A (资料性附录） 12种氨基酸的分子式和相对分子质量 表A.112种氨基酸的分子式和相对分子质量 中文名称 英文名称 分子式 相对分子质量 CAS号 1 精氨酸 Arginine C6H1402N4 174.20 74-79-3 2 丝氨酸 Serine C3HO:N 105.09 56-45-1 3 苏氨酸 Threonine C4H,O:N 119.12 72-19-5 4 甘氨酸 Glycine C2HsO2N 75.07 56-40-6 5 丙氨酸 Alanine C:HO2N 89.09 56-41-7 9 脯氨酸 Proline CsH9O2N 115.13 147-85-3 7 -氨基丁酸 -Aminobutyric acid C4H9O2N 103.12 56-12-2 缬氨酸 Valine CsHi1O2N 117.15 72-18-4 6 异亮氨酸 Isoleucine C6H1302N 131.17 73-32-5 10 亮氨酸 Leucine C6H1302N 131.17 61-90-5 11 色氨酸 ClnH1202N2 204.23 73-22-3 12 苯丙氨酸 Phenylalanine CqHi1O2N 146.19 56-87-1 4 QB/T5197-2017 附录B （资料性附录） 12种氨基酸及葡萄酒样品的色谱图 /μV 200.00 150.00 Gly leLe Pro phe 100.00 ArgSer Gaba Val 50.00- 0.00于 50.00 30'00 32.00 18.00 18.00 20.00 22.00 24'00 128.00 28.00 12'00 14.00 tmin 图B.1 112种氨基酸混标色谱图 /uv Arg 200.00 Pro Gaba Ala 150.00 100.00 lleLe 00'09 Gby Ser 50.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 28.00 28.00 30.00 tmin 图B.2葡萄酒样品色谱图 5