ICS 07.100.30 QB 分类号：X60 备案号：59742-2017 中华人民共和国轻工行业标准 QB/T5165-2017 食品用乳酸菌鉴定技术指南 Guideline for identification of lactic acid bacteria in food 2017-07-07发布 2018-01-01实施 中华人民共和国工业和信息化部 发布 QB/T5165-2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中国轻工业联合会提出。 本标准由全国食品发酵标准化中心归口。 本标准起草单位：中国食品发酵工业研究院、上海交大昂立股份有限公司、中粮营养健康研究院有 限公司。 本标准主要起草人：孟镇、杭晓敏、钟其顶、丁庆波、张曼、张蔚、陈历水、杨彤辉。 本标准为首次发布。 QB/T5165-2017 引言 国际乳品协会（InternationalDairyFederation，IDF）2012年发布455号公告《发酵食品中微生物菌 种安全性论证》（SafetyDemonstrationofMicrobialFoodCulturesinFermentedFoodProducts），公布了 食品用微生物菌种，其中包括细菌195种，在确定细菌分类学地位时，建议采用多相鉴定的方法，即当 菌株和模式菌种在表型和/或基因型具有高度的相似性时，被归为同一种。 2010年原卫生部办公厅印发了可用于食品的菌种名单，包括双歧杆菌属（Bfidobacterium）、乳杆 菌属（Lactobacillus）和链球菌属（Streptococcus）三个属，本指南根据国际相关组织公布的技术文件 中乳酸菌鉴定的指导原则，给出可用于食品的双歧杆菌属、乳杆菌属和嗜热链球菌等乳酸菌的鉴定原则。 I QB/T5165-2017 食品用乳酸菌鉴定技术指南 1范围 本标准规定了可用于食品的双歧杆菌属（Bifidobacterium）、乳杆菌属（Lactobacillus）和嗜热链球 菌（Streptococcusthermophilus）鉴定技术的实验室基本要求、生物安全与质量控制、鉴定原则和鉴定 结果表述。 本标准适用于可用于食品的双歧杆菌属（Bifidobacterium）、乳杆菌属（Lactobacillus）和嗜热链球 菌（Streptococcusthermophilus）的种水平鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB4789.1食品安全国家标准食品微生物学检验总则 GB4789.34食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌的鉴定 GB4789.35食品安全国家标准食品微生物学检验 乳酸菌检验 GB/T19495.3转基因产品检测 」核酸提取纯化方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应。 DNA：deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸。 Genbank：基因库。 EMBL：Theeuropean molecularbiologylaboratory，欧洲分子生物学实验室。 DDBJ：DNAdatabankofjapan，日本DNA数据库。 Taq：thermusaquaticu，水生栖热菌。 dNTP：deoxy-ribonucleosidetriphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸。 dATP：deoxy-adenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸。 dTTP：deoxy-thymidinetriphosphate，脱氧胸苷三磷酸。 dCTP：deoxy-cytidinetriphosphate，脱氧胞苷三磷酸。 dGTP：deoxy-guanosinetriphosphate，脱氧鸟苷三磷酸。 Tris：tris(hydroxymethyl)aminomethane，三（羟甲基）氨基甲烷。 EDTA：ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸。 TE：Tris-HCI、EDTA缓冲液。 16srRNA：16sribosomalribonucleicacid，16s核糖体核糖核酸。 pheS：phenylalanyl-tRNAsynthasealphasubunit，苯丙氨酰-tRNA合成酶α亚基。 bp：basepair，碱基对。 4实验室基本要求和生物安全与质量控制 应符合GB4789.1的规定。 I QB/T5165-2017 5鉴定原则 获得乳酸菌菌种纯培养后，采用表型试验和聚合酶链式反应（PCR）方法相结合的方式鉴定。 5.1表型试验（形态观察及生理生化方法） 根据乳酸菌菌株的培养形态、生理生化特征等内容，与分类系统对照，得到菌株的分类信息。双歧 杆菌属（Bifidobacterium）鉴定可按照GB4789.34规定的方法执行，乳杆菌属（Lactobacillus）和嗜热链 球菌（Streptococcu thermophilus）鉴定可按照GB4789.35规定的方法执行。 5.2PCR方法 根据目标菌种的特定基因序列设计/选择相应的引物，以提取的乳酸菌基因组DNA为模板进行PCR 扩增，对所得的产物进行测序，并将测序得到的DNA序列与国际已有核酸序列数据库（如Genbank、 EMBL、DDBJ等） 中已知参考序列进行同源性搜索比对，得到菌株的种/属信息。双歧杆菌属 (Bifidobacterium) 乳杆菌属（Lactobacillius）和嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus）的PCR鉴定 方法参见附录A。 6鉴定结果表述 根据菌株的核酸序列、形态特征观察和生理生化特征，对照通用的鉴定系统，确定待鉴定菌株的分 类地位。菌种名称来用国际命名规则，使用属名和种加词的拉丁词，并附中文译名，有异名时应同时标 注。 QB/T5165-2017 附录A （资料性附录） 双歧杆菌属（Bifidobacterium）、乳杆菌属（Lactobacillus）和 嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus）的PcR鉴定方法 A.1试剂和材料 除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂，试验用水为灭菌的双蒸水或蒸馏水。 A.1.1TaqDNA聚合酶。 A.1.2dNTP：dATP、dTTP、dCTP、dGTP。 A.1.3 大肠杆菌ATCC25922、目标菌种的模式菌株或参拷菌株。 质控菌株： A. 1.4 琼脂糖。 A.1.5 溴化乙锭或其他可替代的染料。 A.1.6DNA分子量标记：依据目的片段大小选择。 A. 1.7 细菌基因组DNA提取试剂盒 TE缓冲液：/10mmol/LTris-HCI（pH=8.0)、 A.1.8 1mmol/LEDTA(pH=8.0)。 A. 1.9 1×TAE缓冲液：称取242gTris碱，吸取57.1mL冰乙酸，加入100mL0.5mmol/LEDTA（pH=8.0）， A.1.10 琼脂糖凝胶：称取2.0g琼脂糖于锥形瓶中，加入98.0mL1×TAE缓冲液，加热溶解。 A.1.11 10×PCR缓冲液：含Mg*。 A.1.12 6xloadingbuffer（上样液）。 A.1.13 无菌PCR反应管。 A.1.14 无菌离心管：1.5mL、2mL。 A. 2 仪器和设备 A. 2. 1 电子天平： 感量0.001g。 A. 2. 2 PCR仪。 A.2.3 离心机。 A.2. 4 紫外凝胶成像仪 A.2.5电泳仪。 A.2.6微量移液器： 10mL、 100μL200μL、1000μL。 A.2.7 恒温水浴锅 A.2.8超净工作台 A.3分析步骤 A.3.1 菌株活化 乳杆菌属（Lactobacillus）和嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus）按照GB4789.35规定的方法 执行，获得对数生长期液体培养物，双歧杆菌属（Bifidobaeterium）按照GB4789.34规定的方法执行， 获得对数生长期液体培养物。 3