ICS 67.180.20 QB 分类号：X69 备案号：53763-2016 中华人民共和国轻工行业标准 QB/T49152016 工业用角质酶制剂 Cutinase preparations for industry 2016-01-15发布 2016-07-01实施 中华人民共和国工业和信息化部 发布 QB/T4915-2016 前 言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由中国轻工业联合会提出。 本标准由全国食品工业标准化技术委员会工业发酵分技术委员会（SAC/TC64/SC5）归口。 本标准起草单位：江南大学、山东隆大生物工程有限公司、湖南鸿鹰祥生物工程有限公司、武汉 新华扬生物股份有限公司、青岛蔚蓝生物集团有限公司、中国生物发酵产业协会。 本标准主要起草人：李晓燕、陈晟、郭庆文、詹连生、陈亮珍、王永兰、王晋。 本标准为首次发布。 QB/T49152016 工业用角质酶制剂 1范围 本标准规定了工业用角质酶制剂的术语和定义、产品分类、要求、试验方法、检验规则和标志、包 装、运输、贮存。 本标准适用于经微生物发酵、提纯制得的角质酶制剂的生产、检验和销售。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T191包装储运图示标志（GB/T191-2008，ISO780:1997，MOD） GB5009.3一2010食品安全国家标准食品中水分的测定 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，ISO3696:1987，MOD） GB/T23527蛋白酶制剂 QB/T1803-1993工业酶制剂通用试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 角质酶 cutinase 角质水解酶 能催化水解角质得到脂肪酸单体的酶。 3. 2 角质酶活力activityofcutinase 在30℃、pH8.0，每分钟催化对硝基苯丁酸酯水解生成1μmol对硝基苯酚消耗酶量。 4产品分类 按产品形态分为液体和固体两种剂型。 5要求 5.1感官要求 5.1.1液体剂型：黄褐色液体，有特殊发酵气味，可有少量凝聚物。 5.1.2固体剂型：色泽均匀，无结块、无异味。 5.2理化要求 应符合表1规定。 表1理化要求 项目 液体剂型 固体剂型 鉴别 通过试验 通过试验 酶活力*[U/mL(或U/g)] 750 750 pH (25℃) 6.0~9.0 1 QB/T4915-2016 表1（续） 液体剂型 固体剂型 项目 8.0 干燥失重/% ≤ 细度（0.4mm标准筛通过率）*% 80 具体规格可按供需双方合同的要求执行。 b如有特殊要求，按双方合同确定。 试验方法 本标准中所有的试剂和水， 在未注明其他要求时，均指分析纯（AR）和GB/T6682规定的水（三级 水）。本标准中所用的溶液，在未注明任何溶剂配制时，均指水溶液 6.1感官 取适量样品置于清洁、干燥的白瓷盘中，在自然光线下 进行观察。 6.2鉴别 6.2.1原理 角质酶水解角质后生成脂肪酸，通过碱滴定进行鉴别 6.2.2试剂和溶液 实验室常用和下列试剂和溶液适用于本标准。 6.2.2.1草酸缓冲液 称取草酸4.0g，草酸铵16.0g，加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解，定容至1000mL。 6.2.2.2氯仿-甲醇溶液 量取氯仿800mL，甲醇400mL，混合均匀。 6.2.2.3酶处理液 将10g纤维素酶、 10g脂肪酶和10g果胶酶加入1000mL去离子水中溶解。 6.2.2.4醋酸缓冲液（pH4.0） 称取146.0g无水醋酸钠和480.0g冰醋酸，用蒸馏水定容至1000mL 6.2.2.525 mmo1/L磷酸钾缓冲液（pH8.0) 称取三 水磷酸氢二 钾5.59g和磷酸之氢钾0.41g，精确至0.001g，加入约800mL去离子水，充分搅拌 溶解，定容至1000mL。 0.02mol/L氢氧化钠溶液 6.2.2.6 称取氢氧化钠0.8g，精确至0.001g，加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解，定容至1000mL。 6. 2.2.7 酶液 称取固体样品0.1g，精确至0.001g，溶解于约0.3mL去离子水中，搅拌溶解。液体酶液直接使用。 6.2.2.8 苹果角质底物 苹果皮在草酸缓冲液中煮至果肉完全去除，捞出果皮，清洗，真空干燥，剪碎；苹果皮放入在1L 氯仿-甲醇溶液中搅拌萃取过夜，过滤、清洗、真空干燥；苹果皮在1L酶处理液中搅拌过夜，过滤、清 洗、真空干燥；重复上述氯仿-甲醇溶液萃取和酶处理液处理步骤。苹果皮在醋酸缓冲液中处理搅拌处 理16h，过滤、清洗、真空干燥。 6.2.3仪器 实验室常用和下列仪器适用于本标准。 6.2.3.1 自动移液枪（50μL、200μL、1mL、5mL） 6.2.3.2 碱式滴定管（10mL）。 2 QB/T4915-2016 6.2.3.3恒温水浴锅。 6.2.3.4离心管（1.5mL、5mL）。 6.2.3.5真空干燥箱。 6.2.3.6抽滤瓶（1L）。 6.2.4鉴定试验 反应体系10mL，包括10g/L苹果角质、25mmol/L磷酸钾缓冲液（pH8.0）、0.25mL酶液，空白 用上述磷酸钾缓冲液代替酶液，50℃，150r/min保温4h，用0.02mol/L的氢氧化钠溶液滴定生成的脂 肪酸，其中氢氧化钠净用量大于2mL为通过鉴别。 6.3酶活力 6.3.1原理 角质酶水解角质后生成的脂肪酸可通过碱滴定进行定量；角质酶水解对硝基苯丁酸酯（pNPB）产 生的对硝基苯酚在405nm处显色，可通过分光光度法定量。 6.3.2试剂和溶液 实验室常用和下列试剂和溶液适用于本标准。 6.3.2.1三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（10mmol/L、pH8.0的Tris-HC1缓冲液）：称取三羟甲基氨基 甲烷（Tris）1.210g、氯化钠0.584g，加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解，用盐酸（HCI）调节pH 至8.0，定容至1000mL。 6.3.2.250mmol/L对硝基苯丁酸酯溶液：称取对硝基苯丁酸酯（pNPB）0.1046g，用乙定容至10mL， -18℃保存。 6.3.3仪器 实验室常用和下列仪器适用于本标准。 6.3.3.1可见分光光度计。 6.3.3.2恒温水浴锅。 6.3.3.3玻璃比色皿。 6.3.3.4自动移液枪（50μL、200μL、1mL、5mL）。 6.3.3.5离心管（1.5mL、5mL）。 6.3.4样品的制备 6.3.4.1固体酶液的制备 取样品溶解、搅拌，取上清液进行适当稀释，稀释倍数以控制吸光值A在0.2～0.5为宜。 6.3.4.2液体酶液的制备 取样品进行适当稀释，稀释倍数以控制吸光值A在0.2～0.5为宜。 6.3.5测定 6.3.5.1对硝基苯酚标准曲线的制作： 称取0.0139g对硝基苯酚，用Tris-HCI缓冲液定容至1000mL，配制成100μmol/L的对硝基苯酚 母液，再用10mmol/L、pH8.0的Tris-HCI缓冲液稀释至0μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、 80μmol/L、100μmol/L。缓冲液在30℃水浴中保温，以去离子水调零，用1cm玻璃比色血在分光光度 计上测定波长为405nm时的吸光值，以对硝基苯酚浓度c为横坐标，吸光值A为纵坐标，绘制标准曲 线A=a×c+b（标准曲线的相关性系数需达到0.999以上）。 6.3.5.2角质酶活力测定： 缓冲液在30℃水浴中保温，用移液枪准确移取Tris-HC1缓冲液1.5mL至1cm玻璃比色皿中，在吸收 波长405nm处调零。用移液枪准确移取Tris-HCl缓冲液1.44mL至1cm比色血中，用移液枪移取30μL待 3 QB/T49152016 测稀释样品，加入上述比色血中，然后用移液枪移取30μL底物溶液，加入上述比色血中，摇匀后立即 放入可见分光光度计中，在吸收波长405nm处测吸光值A。每隔5s记录一次吸光值A，反应时间为1min。 6.3.6计算 (K-b)×V X = XN (1) a×V,×1000 式中： X 角质酶酶活力，U/mL（或U/g）； K 酶反应所测不同时间A值（纵坐标）和时间（min）所成曲线的斜率； b 对硝基苯酚标准曲线的常数； Vi 反应体积，单位为毫升（mL）； 对硝基苯酚标准曲线的斜率； D V2 加酶量，单位为毫升（mL）； N 稀释倍数。 6.3.7允许误差 平行试验相对误差不应超过5%。 6.4 pH 按QB/T1803一1993规定的方法测定。 6.5干燥失重 按GB5009.3一2010中第一法进行测定。 6.6细度 按GB/T23527规定的方法测定。 7检验规则 7.1批次的确定 生产厂以同一批次生产的且经包装出厂的、具有同样工艺条件、同一产品名称、原料、规格和同样 质量证明书的产品为一批。 7.2抽样与留样 7.2.1取样应均匀分布在整个灌装过程中，或均匀分布于灌装后的成品中。 7.2.2取样时应采用适宜的方法保证取样具有代表性，保证取样部位和取样瓶的清洁。对用于微生物 检验的取样，应使用无菌操作。 7.2.3成品抽样的样本量见表2。取样的样本量可以按照估计的批量参照表2执行，或由生产企业和 （或）相关方确定。批取样量不应小于500g（或500mL），不足时补至500g（或500mL）。 表2成品抽样的样本量 批量/桶或箱 样本量/（桶或袋） Os> 2 51~50