ICS 11.040.01 YY CCS C 30 中华人民共和国医药行业标准 YY/T1808—2021 医疗器械体外皮肤刺激试验 In vitro skin irritation test for medical devices 2021-09-06发布 2022-09-01实施 国家药品监督管理局 发布 YY/T1808—2021 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由国家药品监督管理局提出。 本文件由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会（SAC/TC248)归口。 本文件起草单位：山东省医疗器械产品质量检验中心、中国食品药品检定研究院、北京市医疗器械 检验所、济南磐升生物技术有限公司。 本文件主要起草人：范春光、刘佳、陈亮、王蕊、邢志青、陈丽媛、戴政宁、张平。 I YY/T1808—2021 引言 将从健康志愿者获取的正常角蛋白细胞在薄膜或滤纸上的气液交界面培养数日后可形成包括基底 层、棘层、颗粒层和有功能的角质层在内的三维皮肤模型，即重建人表皮模型。此模型起初是为检测纯 化学物体外皮肤刺激性而研发的。近年来，此类模型也被用于检测医疗器械中的刺激性物质。 YY/T1808—2021 医疗器械体外皮肤刺激试验 1范围 本文件规定了采用重建人表皮（RhE)模型进行医疗器械体外皮肤刺激试验的方法 本文件适用于采用RhE模型进行体外皮肤刺激试验评价医疗器械潜在的皮肤刺激性 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件。 GB/T16886.10 医疗器械生物学评价第10部分：刺激与皮肤致敏试验 GB/T16886.12 2医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照材料 3 术语和定义 GB/T16886.10和GB/T16886.12界定的术语和定义适用于本文件。 4 试验原理 医疗器械/材料的极性和非极性浸提液或器械/材料本身可直接接触RhE模型的上表面，孵育一定 时间后冲洗除去表皮上的试验样品，再用四甲基偶氮唑盐（MTT)试验检测RhE模型细胞活性，与阴性 对照相比得到组织活度，根据组织活度预测试验样品的刺激性。 5材料 5.1J RhE模型 使用商品化RhE模型进行试验。RhE模型的说明见附录A。 表皮细胞应取自人类免疫缺陷病毒（HIV)1、2抗体、丙型肝炎抗体、乙肝等抗原均阴性的健康志愿 者。本文件的使用者宜建立相应的安全和健康规程以确保生物安全。 5.2 仪器设备 仪器设备如下： a） 超净工作台。 b) 生物安全柜。 细胞培养箱。 d）天平。 酶标仪。 f) 水平摇床。 1 YY/T 1808—2021 涡旋振荡器。 h) 移液器（200μL、1mL）、活塞排代式移液器（100μL）、连续分液器 计时器。 5.3 试剂耗材 试剂耗材如下： a) 皮肤模型培养基（由皮肤模型制造商提供，与皮肤模型配套使用）。 b) 杜氏磷酸缓冲盐溶液（DPBS,1X）。 c) 氯化钠注射液（质量浓度：0.9%）。 d) 芝麻油（高纯度或药用级）。 MTT。 e) f) 十二烷基硫酸钠（SDS，质量浓度：20%）。 g) 异丙醇（分析纯）。 h) 6孔培养板、24孔培养板、96孔培养板（平底）。 i) 无菌离心管。 j) 冲洗液收集瓶。 k) 弯头钝头镊子。 1) 大漏斗。 m) 封口膜。 n) 锡箔纸。 o) 无菌棉棒。 6 试验步骤 6.1 浸提液及对照液的制备 6.1.1 浸提液的制备 应按照GB/T16886.12制备医疗器械和/或材料浸提液，注意无菌操作。 宜使用0.9%氯化钠注射液作为极性浸提介质制备极性浸提液，宜使用芝麻油作为非极性浸提介质 制备非极性浸提液。若使用其他浸提介质，应证明浸提介质不影响试验系统 宜基于GB/T16886.12论证浸提时间和温度， 不适合浸提的医疗器械和/或材料进行试验时，宜论证其适用性。 6.1.2对照液的制备 6.1.2.1阴性对照 无菌DPBS1×）。 6.1.2.2 介质对照 应将介质对照置于浸提容器中并进行与医疗器械和/或材料相同的浸提程序。 6.1.2.3 阳性对照 1%的SDS溶液。取0.5mL20%SDS水溶液与9.5mL相应浸提介质，用漩涡振荡器充分混匀。 2 YY/T1808—2021 注1：使用试验当天新鲜制备的阳性对照，推荐使用商品化20%SDS溶液制备阳性对照。对不适合浸提的试验样 品进行试验时，可用无菌DPBS制备SDS阳性对照。 注2：若试验样品与MTT试剂反应，或将组织或细胞染色且在冲洗后仍有一定量的残留，试验结果可能会被干扰 在这种情况下，可设置适宜的对照以消除干扰。 6.2 2RhE模型的准备及预孵育 接收皮肤组织后，根据模型制造商的说明将模型放入大小合适的培养板（如6孔培养板）中，用配套 培养板盖子。用镊子小心拿出盛有皮肤组织的小室，在无菌纱布或滤纸上轻轻除去粘附在小室外侧缘 的残留琼脂。检查确认无残留后将模型转移至新鲜培养基，倾斜小室避免底部产生气泡。根据制造商 说明书预孵育皮肤模型。 注：保存运送组织的琼脂培养板室温下密封数日能观察有无污染迹象。 6.3加样和冲洗 6.3.1总则 虽然采用不同模型进行的体外皮肤刺激试验都遵循相同原则，但不同模型的具体操作可能存在差 异。接触时间等条件宜遵从制造商说明书的规定。 6.3.2准备 室温预热培养基。加样前约5min从培养箱中拿出预孵育的培养板。加样前准备大小合适的培养 板（根据制造商的要求选择）用于RhE模型与样品及对照的孵育。用代码标记培养板盖子，每个试验样 品（如样品1的两种浸提液可记为T1-1和T1-2）、阳性对照（可记为PC1和PC2）、介质对照（可记为 VC1和VC2)和阴性对照（可记为NC)分别使用3块组织。更换小室下的培养基或将小室移人含新鲜 培养基的培养板中。检查培养板底部以确认转移过程中无气泡产生。 6.3.3加样 排代式移液器吸取黏稠液体）。用枪头轻轻将液体铺在皮肤上表面。加样完成后，转移培养板至培养箱 （37℃±1℃，5%CO2土1%CO2，相对湿度95%）孵育至制造商规定时间。 注1：记住加样顺序，因冲洗顺序要与加样顺序一致 注2：因模型表面是疏水的，所以要确保100uL溶液均匀涂布在表皮的整个表面。在表面张力作用下，有时极性溶 剂微滴只能分布到表皮的外缘。这种情况下，可使用枪头铺开样品或使用子敲击小室使样品覆盖整个表 皮。另外，对于油性浸提液或1%SDS芝麻油乳浊液，可使用头端球状的玻璃器具或移液器吸头铺开液体以 保证其与整个表皮完全接触。 6.3.4冲洗 孵育后，使用连续分液器吸取灭菌DPBS彻底冲洗组织，推荐冲洗15～25次以去除残留试验材料， 根据组织制造商提供的具体说明进行。冲洗不能太轻柔，否则试验样品不能完全清除，可使用天漏斗和 塑料瓶收集冲洗液，注意防止飞溅和污染。冲洗后，在无菌吸水纸上反扣小室排干水分。使用棉签轻轻 拭干表皮表面，并用吸水纸或棉签拭干小室底部。转移小室至预先加有新鲜培养基（0.3mL/孔）的 24孔板中临时存储，准备进行MTT孵育。若发现皮肤表面仍有残存试验样品，使用无菌棉棒去除并 记录。 3 YY/T1808—2021 6.4RhE模型MTT孵育及吸光度测定 6.4.1MTT孵育 6.4.1.1MTT母液配制 将MTT粉末溶解于DPBS中，质量浓度为5mg/mL。MTT充分溶解后，使用0.22um滤膜过 滤，用锡箔纸包裹避光一20℃保存，可保存1年。 6.4.1.2MTT工作液配制 用室温预热的培养基将MTT母液稀释至1mg/mL。 注：MTT工作液要现配现用。 6.4.1.3转移及孵育 从临时存储板中移出小室，使用无菌吸水纸或无菌棉签拭干小室底部，然后将其转移至预先加人 0.3mLMTT工作液的24孔板中，使用锡箔纸包裹避光。将培养板放人培养箱（37℃土1℃，5%CO土 1%CO2，相对湿度95%）孵育180min士5min。 6.4.1.4萃取 MTT孵育完成后，拭干小室内外所有残留MTT溶液，根据组织制造商说明转移组织至合适的盛 有适量异丙醇的组织培养板中。使用封口膜密封容器或培养板防止液体挥发。记录开始时间，用培养 板振荡器（120r/min)室温振荡至少120min土5min。使用枪头或注射针刺破组织得到相应孔中的萃 取液。用加样器至少混匀3次至溶液均匀后转移至96孔板。 注：上述密封平板在不振荡条件下可在室温或冰箱内避光过夜萃取（18h～24h）。收集萃取液前使用振荡器振荡 平板至少15min。 6.4.2吸光度测定 根据模型制造商说明从每个试验孔中转移200uμL液体至平底96孔培养板中（适当标记），平行 3孔。使用酶标仪根据制造商说明在合适的波长下测定吸光度（OD）值，通常使用570nm波长。异内 醇溶液作为空白对照，平行6孔 注：及时测量，避免96孔板中异丙醇蒸发。 7 数据计算步骤 以下计算步骤适用于不与MTT试剂反应、无色、不会将组织染色、非特异性OD值小于或等于阴 性对照的5%的试验样品。 b) c）1 PC：同法计算PC组每块组织的OD值。用下式计算PC组每块组织的组织活度： OD. VD= ×100 ODNC 式中： VD 一组织活度，%； OD. -PC、VC或试验样品组每块组织的OD值； ODNCNC组OD值。 4