ICS11.040.01 YY CCS C 30 中华人民共和国医药行业标准 YY/T1806.2—2021 生物医用材料体外降解性能评价方法 第2部分：贻贝黏蛋白 Evaluation method for in vitro degradation performance of biomedical materials- Part 2 :Mussel adhesive protein 2021-09-06发布 2022-09-01实施 国家药品监督管理局 发布 YY/T1806.2—2021 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件是YY/T1806《生物医用材料体外降解性能评价方法》的第2部分。YY/T1806已经发布 了以下部分： 一一第1部分：可降解聚酯类； 一第2部分：贻贝黏蛋白 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由国家药品监督管理局提出。 本文件由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会（SAC/TC248)归口。 本文件起草单位：江阴贝瑞森生化技术有限公司、山东省医疗器械产品质量检验中心、中国食品药 品检定研究院。 本文件主要起草人：顾辰昊、陈方、杜晓丹、宋茂谦、孟晓依、徐红。 1 YY/T1806.2—2021 引言 贻贝黏蛋白是提取自海洋贻贝的足丝腺经纯化后获得的高纯度单一蛋白质。贻贝黏蛋白具有通过 自氧化交联形成聚合物的特性，具有广谱粘接性，可形成抗水保护膜并具有良好的生物相容性，在生物 医药领域的应用越来越广泛。 人体的不同部位有着不同的生理环境，同一生物材料在不同的应用环境中，其自身的酶解和所引发 的人体免疫系统反应都是不相同的。研究表明贻贝黏蛋白的降解主要为酶解，适宜的贻贝黏蛋白降解 性能评价标准方法可以促进贻贝黏蛋白的性能研究和产品开发，也可为相关产品的质量控制提供方法。 由于贻贝黏蛋白产品剂型、适应症的多样性，本文件未给出适用于所有产品的具体试验方法。在进行特 YY/T1806旨在建立生物医用材料体外降解性能评价方法，拟由两个部分构成。 第1部分：可降解聚酯类。目的在于给出可降解聚酯类生物医用材料/器械的体外降解性能评 价方法。 一第2部分：贻贝黏蛋白。目的在于给出贻贝黏蛋白生物医用材料/器械的体外降解性能评价 方法。 II YY/T1806.2—2021 生物医用材料体外降解性能评价方法 第2部分：贻贝黏蛋白 1范围 本文件规定了贻贝黏蛋白材料/器械体外降解性能评价方法。 本文件适用于贻贝黏蛋白材料/器械体外降解性能评价。 规范性引用文件 2 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件。 GB/T16886.12 2医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照材料 GB/T16886.13医疗器械生物学评价第13部分：聚合物医疗器械降解产物的定性与定量 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 固定化酶 immobilizedenzyme 在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。 3.2 体外降解 invitrodegradation 在模拟生理环境中发生的降解。 体外降解试验设计 4 4.1概述 将经过处理的适量试样置于容器中，加人相应量的降解介质，涡旋均匀并密封容器，保持适宜的温 度。在试验的不同周期取样，用于贻贝黏蛋白降解性能的评价。 4.2仪器 高效液相色谱仪（HPLC)或氨基酸分析仪、电子天平、pH计、离心机、烘箱等， 4.3容器 按照GB/T16886.12的要求，降解试验应在洁净、可密闭的、化学惰性的容器中进行。 4.4溶液配制 50mmol/LTris-HCl缓冲液：取1.25mL2mol/LTris溶液，加饱和NaCl溶液稀释至50mL，以 1 YY/T1806.2—2021 HCl调节pH至9.5士0.2，室温配制。 4.5 供试品制备 取液体待测样品40mL（凝胶取待测样品40g）与40mL50mmol/LTris-HCl缓冲液混合，涡旋 混匀，分装到离心管中，5mL/管，密封37℃放置48h，然后高速离心（16000g，5min），弃去上清液，沉 淀用50mmol/LTris-HC1缓冲液洗涤两次，制备成供试品。 4.6 试验步骤 试验设计遵循GB/T16886.13中试验溶液应尽可能与预期的聚合物医疗器械的应用环境相同的 采用磷酸缓冲液（PBS)中添加胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶配制，其中胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋 白酶的活性比为10：10：1，总酶活性不低于84U/mL的混合固定化酶。固定化酶质量浓度应大 于5%。 注：固定化酶可采用市售品，也可自行配制和制备。固定化酶制备方法见附录A。 取适量供试品加入降解介质中，供试品和降解介质的比例可根据供试品浓度和固定化酶活性调整。 混合均匀并持续搅拌，按设定的时间取样。 每个时间点至少3份样品，每份样品单独使用一个容器。 每个时间点至少1个空白对照，以证明容器、试验溶液等对分析不产生干扰。 4.7 降解温度 降解过程的温度宜为（37士1)℃。 4.8 时间点设置 应至少包含5个时间点（包括零点）以得出降解趋势，降解终点的设置宜基于试验目的，可考虑下列 情况： a）达到了基于风险分析后设定的时间；或 b） 完全降解为氨基酸，中间取样点根据实际情况设置。 5降解结果评价 5.1降解率 取相应时间点的供试品，高速离心（16000g，5min）后取上清液，以适宜的方法水解为氨基酸（零 点供试品直接水解），进行氨基酸定量分析，测定不同时间点降解产物的氨基酸总浓度（umol/mL）。计 算不同时间点降解产物的氨基酸总浓度与供试品中氨基酸的初始总浓度的比值，记为该样品的降解率， 用下式计算： DR==×100 C o 式中： DR——降解率，%； 测试点氨基酸浓度，单位为微摩尔每毫升（umol/mL）； 初始氨基酸浓度，单位为微摩尔每毫升（μmol/mL）。 5.2 数据处理 数据处理如下： 2 YY/T1806.2—2021 计算3份样品数据相对平均偏差（RAD)，不得超过15%； a) b）取3份样品数据平均值，绘制样品降解率随时间的变化趋势图，对降解结果进行描述。 6 试验报告 试验报告宜包括以下信息： a) 试样名称、规格、生产批号和数量的描述； b） 降解介质； c) 降解温度； (p 试验方法的详细描述和论证； e) 试验结果。 3 YY/T1806.2—2021 附录A （资料性） 固定化酶制备方法 A.1溶液配制 溶液A：0.1mol/LNaHCO，（含0.5mol/LNaCl，pH8.3）：称取NaHCO：固体8.40g，NaCl固体 29.22g于1L烧杯中加人纯化水800mL溶解，溶解后将溶液转移至1L容量瓶定容至1L，即得。 1L烧杯中加入纯化水800mL溶解，溶解后使用1mol/L的HCl溶液调节pH至8.0，将溶液转移至 1L容量瓶定容至1L，即得。 溶液C：0.1mol/L乙酸钠（NaAc）/乙酸（AcOH）（pH4.0，含0.5mol/LNaCI）：称取NaAc固体 16.41g，于1L烧杯中加人纯化水800mL溶解，溶解后将溶液转移至1L容量瓶定容至1L，即得 0.2mol/LNaAc溶液。取AcOH含量>99.5%的无水AcOH溶液11.5mL定容至1L，即得0.2mol/L AcOH溶液。取500mL0.2mol/LNaAc溶液使用0.2mol/LAcOH溶液调节pH至4.0，即得0.2mol/L pH4.0的NaAc/AcOH缓冲液。取0.2mol/LpH4.0的NaAc/AcOH缓冲液500mL于1L烧杯中， 加入纯化水300mL，NaC1固体29.22g溶解，溶解后将溶液转移至1L容量瓶定容至1L，即得。 A.2制备方法 取悬浮于乙醇/丙酮中的溴化氰（CNBr）活化琼脂悬浊液15mL，抽滤，用1mmol/LHCl溶液冲洗 树脂，每次用量100mL，抽尽溶液，冲洗树脂3次后，抽干液体称量琼脂湿重。用30mL溶液B配制 0.15mg/mL的胰蛋白酶或0.15mg/mL糜蛋白酶或0.6mg/mL的弹性蛋白酶溶液，与冲洗称重后的 CNBr活化琼脂混合，4℃温和震荡（1O0r/min)过夜后抽干液体。使用50mL溶液A冲洗树脂后抽干 溶液，树脂转移至溶液B中，室温放置2h。使用50mL的溶液C与50mL的溶液B交替冲洗抽滤树 脂3遍，抽干，即得。 4