ICS 11.040.30 YY CCS C30 中华人民共和国医药行业标准 YY/T1805.2—2021 胶原蛋白 组织工程医疗器械产品 第2部分：I型胶原蛋白分子量检测 干二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法 Tissue engineering medical device products-Collagen protein- Part 2 : Determination of molecular weight of type I collagen- Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis 2021-09-06 发布 2022-09-01实施 国家药品监督管理局 发布 YY/T1805.2—2021 目 次 前言 II 引言 IV 1 范围 2 规范性引用文件 术语和定义 缩略语 4 原理 6 试剂及其配制 7 仪器和设备 操作方法 9 结果 10 可接受准则 YY/T1805.2—2021 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 厂第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件是YY/T1805《组织工程医疗器械产品 胶原蛋白》的第2部分。YY/T1805已经发布了 以下部分： 一第2部分：I型胶原蛋白分子量检测 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由国家药品监督管理局提出。 本文件由全国外科植入物和矫形器械标准化技术委员会组织工程医疗器械产品分技术委员会 (SAC/TC110/SC3)归口。 本文件起草单位：中国科学院过程工程研究所、四川省食品药品检验检测院、中国食品药品检定研 究院。 本文件主要起草人：张贵锋、刘兴兰、高建萍、张乐、邢芳毓、背彬、高小艳、范行良 II YY/T1805.2—2021 引言 用于再生医疗的胶原蛋白类材料包括组织提取的胶原蛋白提取物和基因重组的胶原蛋白肽。其 中，I型胶原蛋白被广泛应用于各种医疗器械产品的研发。胶原蛋白类材料具有不同的特性，如：分子 量的大小、纯度、种属及型别差异、三螺旋结构、细胞黏附特性等，这些性能直接关系着胶原蛋白的质量 和使用性能。“YY/T1805组织工程医疗器械产品胶原蛋白”旨在建立胶原蛋白某些特殊性能的检 测和表征方法，拟由4个部分构成。 第1部分：术语和定义。目的在于制定包括组织提取的胶原蛋白和基因重组胶原蛋白肽的各 种术语和定义。 一第2部分：I型胶原蛋白分子量检测 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法。目的在于提 供可用于胶原蛋白分子量检测的具体方法。 检测，以及种属来源和型别鉴别的方法。 第4部分：胶原蛋白三螺旋结构表征方法。 目的在于建立胶原蛋白三螺旋结构的表征方法，用 于评价其三螺旋结构的有无及其完整性。 IV YY/T1805.2—2021 组织工程医疗器械产品 品胶原蛋白 第2部分：I型胶原蛋白分子量检测 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法 1范围 本文件规定了用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)测定I型胶原蛋白分子量的 方法。 本文件适用于组织提取的I型胶原蛋白（原材料）分子量的测定 注：其他类型胶原蛋白或重组胶原蛋白，如果有对照品可参考本方法进行其分子量测定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 本文件。 YY/T1453一2016组织工程医疗器械产品I型胶原蛋白表征方法 3术语和定义 YY/T1453一2016界定的及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳sodiumdodecyl sulfatepolyacrylamidegelelectriophoresis； SDS-PAGE 一种变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸 钠（SDS)按重量比结合成复合物，使所带负电荷远远超过天然蛋白质本身原有电荷，消除了不同蛋白质 分子的电荷效应，使蛋白质按分子量大小分离， 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Gly 甘氨酸（Glycine）； HC1 盐酸(Hydrochloricacid); Marker 分子量标准品（Molecularweightstandard）； MBA N，N'-亚甲基双丙烯酰胺（N,N'-Methylenebisacrylamide）； NaOH 氢氧化钠（Sodiumhydroxide）； SDS 十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate）； TEMED 四甲基乙二胺（N，N,N',N'-Tetramethylethylenediamine)； Tris 三羟甲基氨基甲烷LTris（hydroxymethyl)methylaminomethane」； Tris-HCl 三羟甲基氨基甲烷盐酸［Tri(Hydroxymethyl）AminoMethaneHydrochloride]。 1 YY/T1805.2—2021 5原理 SDS-PAGE分离蛋白质的原理是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠 (SDS)按重量比结合成复合物，使所带负电荷远远超过天然蛋百质本身原有电荷，消除了不同蛋白质分 子的电荷效应，使蛋白质按分子量大小分离。根据蛋白质分子量标准品在电泳中的迁移距离和其相对 分子质量的对数值成正比的关系拟合标准曲线，根据样品的迁移率可计算出样品相对分子质量的近 似值。 6试剂及其配制 6.1试剂要求 所用试剂均应符合以下要求： a）所用试剂均为分析纯及以上； b）纯化水电阻率不低于18.2MQ·cm； c） I型胶原蛋白对照品建议用国家标准品； d) Markcr的分子量范围应涵盖供试品的分子量。 注：由于动物种属不同，其组织提取的胶原蛋白分子量存在差异，宜根据拟测试样品的动物种属不同选择相同种属 动物组织来源的I型胶原蛋白对照品（如牛I型、猪I型）。 6.2 2试剂及试剂配制 所用试剂均为分析纯，试剂配制方法如下： 解，加水定容至100mL，2℃～8℃避光保存； b）1mol/LTris-HCI溶液（pH6.8,B液）：精确称取Tris12.1g加水溶解，用HCl调pH值至 6.8，加水定容至100mL，2℃～8℃保存； c) 1 1mol/LTris-HCl溶液（pH8.8，C液）：精确称取Tris12.1g，加水溶解，用HCl调pH值至 8.8，加水定容至100mL，2℃～8℃保存； d）10%SDS溶液（D液）：精确称取SDS1.0g加水5mL溶解，加水定容至10mL，2℃～8℃保 存，一周内使用； e）10%过硫酸铵（E液）：精确称取过硫酸铵1.0g加水5mL溶解，加水定容至10mL，临用前 配制； f) 甘氨酸电泳缓冲液（5X）：精确称取Tris15.1g，Gly94.0g，SDS5.0g，加水溶解，加水定容至 1000mL，室温保存，临用时做5倍稀释； g) SDS样品缓冲液（5×）：取b）溶液0.6mL，d）溶液2mL，溴酚蓝0.01g，丙三醇2.5mL，水 4.4mL，临用前加β-巯基乙醇500μL混匀； h） 染色液：精确称取考马斯亮蓝R-2500.5g，加人乙醇225mL、水225mL、冰醋酸50mL，混勾； 脱色液：量取乙醇800mL、水100mL、冰乙酸100mL混匀， 注：以上试剂也可用市售成品。 7仪器和设备 所用仪器和设备规格参照以下要求： 2 YY/T1805.2—2021 a) 分析天平(0.0001g)； b) 电泳仪； c) 电泳槽； d) 微量注射器，5μL、10μL； e) 离心机； f) 水浴锅； 凝胶影像分析系统。 g) 8 操作方法 8.1 样品变性处理 8.1.1 固体样品 称取供试品适量（胶原蛋白含量约5mg）加水8mL，SDS样品缓冲液（5×）2mL，混合后于100℃ 水浴加热5min~10min使蛋白质变性，离心（650g，5min~10min）； 8.1.2 液体样品 取液体样品适量（胶原蛋白含量约5mg），加水至终体积为8mL，SDS样品缓冲液（5×）2mL，混 合后于100℃水浴加热5min~10min使蛋白质变性，离心（650g，5min~10min）。 注：如果样品溶解后的pH值非中性时需要在加SDS样品缓冲液之前用NaOH或HCI调整pH值至中性。 8.2 电泳凝胶制备 8.2.1 凝胶溶液组成 不同凝胶的组成见表1。 表 1 凝胶溶液组成 凝胶种类 试液 分离胶溶液（7.5%）/mL 浓缩胶溶液（5%）/mL 水 2.82 2.1 A液 1.5 0.5 C液 2.28 B液 0.38 D液 0.06 0'0 E液 0.06 60'0 TEMED 0.008 0.005 注：以上试剂也可用市售凝胶成品或凝胶溶液，凝胶中丙烯酰胺5%～15%，分离胶和浓缩胶比例为推荐条件， 可进行适当调整。 8.2.2 分离胶制备 根据表1配制分离胶溶液，灌人凝胶板内至一定高度，加水封顶，室温下聚合（室温不同，聚合时间 3