ICS_11.040.30 YY C 35 中华人民共和国医药行业标准 YY/T 1744—2020 组织工程医疗器械产品 生物活性陶瓷 多孔材料中细胞迁移的测量方法 Tissue engineeringmedicaldeviceproductsBioactive ceramicsMethod to measure cell migration in porous materials (ISO 19090:2018 Tissue-engineered medical products—Bioactive ceramics-Method to measure cell migration in porous materials,MOD) 2020-09-27发布 2021-09-01实施 国家药品监督管理局 发布 YY/T1744—2020 目 次 前言 II 引言 IV 范围 规范性引用文件 术语和定义 3 4 原理 试验样品 2 试验步骤 7 计算 8试验报告 10 参考文献 12 YY/T1744—2020 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准使用重新起草法修改采用ISO19090：2018《组织工程医疗产品生物活性陶瓷多孔材料 中细胞迁移的测量方法》。 本标准与ISO19090：2018的技术性差异及其原因如下： 关于规范性引用文件，本标准做了具有技术性差异的调整，以适应我国的技术条件，调整的情 况反映在第2章“规范性引用文件”中，具体调整如下： 用等同采用国际标准的GB/T16886.5代替ISO10993-5。 本标准还做了下列编辑性修改： 删除了ISO19090：2018的附录A（资料性附录）“用于确定实验条件的实验结果”； 删除了ISO19090：2018的附录B（资料性附录）“国际比对循环测试结果”。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家药品监督管理局提出。 本标准由全国外科植入物和矫形器械标准化技术委员会组织工程医疗器械产品分技术委员会 (SAC/TC110/SC3)归口。 本标准主要起草人：梁洁、魏利娜、杨晓琴、蔡永福、袁瞰、张乐、徐丽明。 YY/T1744—2020 引言 生物活性陶瓷因其具有良好的生物活性和生物亲和性，被广泛用于骨科和牙科领域。而多孔的生 物活性陶瓷，细胞可从组织进人其孔隙，从而具有有效修复骨缺损的潜力，成为骨组织工程医疗产品细 胞支架的潜在候选“原材料”之一。 为了证明生物活性陶瓷的临床安全性和有效性，首先须对其物理，化学和生物特性进行检测。在所 使用的方法中，动物试验是检测生物活性陶瓷的生物学特性最重要和必要的方法；然而，在3R原则（替 代replacement，减少reduction，优化refinement)下，必须减少动物和动物试验的数量。 细胞迁移能力是多孔生物材料（包括生物活性陶瓷）的首要和最重要的性能。在多孔生物材料及其 目前有两种细胞接种方法用于测试细胞迁移能力：一种是将细胞悬液滴到多孔材料表面，这种方法 测试了细胞悬液在重力作用下的穿透能力；另一种是将多孔材料加到细胞悬液中通过摇晃驱使细胞进 材料中。这两种方法只能检测细胞的穿透和留存能力，但是不能模拟在体内的细胞迁移情况。体液 本身足以携带细胞穿过植入材料和宿主骨组织之间的较小间隙。因此，自前还没有模拟体内细胞行为 的细胞迁移测试方法的报道。 当多孔生物陶瓷植入骨缺损部位时，细胞迁移到孔中形成新骨。在这个过程中，成骨细胞的迁移在 骨传导中扮演重要角色。也就是说，没有成骨细胞迁移，就不会发生骨传导或骨形成。 因此需要建立一种可量化且模拟细胞在体内的行为的方法来测量多孔生物活性陶瓷的细胞迁移潜 能，以便客观地评估其作为组织工程医疗产品支架材料的潜力。 80.9%，孔结构为无序，球形）、HTL(HA：β一TCP=6：4，平均孔径390.3μm，孔隙率81.7%，孔结构 为无序，球形）、TH(HA：β-TCP=1：9，平均孔径375.4μm，孔隙率81.6%，孔结构为无序，球形）、 THL(HA：β一TCP=3：7，平均孔径293.8μm，孔隙率77.7%，孔结构为无序，球形），验证了本标准 中给出的方法用于评价多孔生物陶瓷的细胞迁移潜能是可行的和可操作的。 IV YY/T1744—2020 组织工程医疗器械产品生物活性陶瓷 多孔材料中细胞迁移的测量方法 1范围 本标准规定了用于测量和记录多孔生物活性陶瓷材料中细胞迁移的测试方法。 本标准适用于多孔生物活性陶瓷。 本标准不适用于低细胞黏附性或无细胞黏附性的多孔材料，例如合成聚合物和金属。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T16886.5医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验（GB/T16886.5一2017， ISO10993-5:2009,IDT) 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 生物陶瓷 bioceramics 植入人体内增强生物功能的陶瓷材料。 3.2 生物活性陶瓷 bioactiveceramics 当植入到骨缺损部位后具有引导骨结合性能的生物陶瓷。 3.3 生物材料 biomaterials 用于诊断、治疗、修复或替换机体组织、器官或增进其功能的材料。 ［YY/T1445—2016，定义3.19] 3.4 完全汇合fullconfluent 单层细胞几乎完全（～95%～100%）覆盖细胞培养血。 3.5 完全培养基 completemedium 用于所选细胞类型的含有所有必需添加物的细胞培养基。该细胞培养基经使用者验证对细胞增殖 有益且不会使细胞发生突变。 3.6 成骨样细胞 osteoblast-likecell 已建立的被广泛认可具有“成骨活性”的细胞系。 1 YY/T1744—2020 3.7 细胞群cellgroup 由至少五个细胞组成的群，且每个细胞之间距离不超过细胞自身的宽度。 4原理 本方法可以简单有效地测量细胞自身迁移能力。如图1所示，培养血内汇合层中的细胞能够进一 步迁移至培养血内多孔生物陶瓷材料中并增殖。为了尽量减少因细胞传代、细胞种类、细胞培养耗材 （包括培养基和血清等）差异造成的影响，本方法采用一种具有代表性的且已上市并在各国临床使用中 证明有良好效果的多孔生物活性陶瓷作为计算相对迁移距离的参考材料。 a）材料放置前：试验材料中不包含细胞 b) 材料放置后：细胞通过孔隙上移至测试材料 说明： 1——含培养基的培养皿； 2 黏附于培养血底部的细胞； 3——试验材料。 图1测试方法示意图 细胞移行到材料界面之后，开始逐步向材料孔隙中迁移。这种迁移距离因材料性质，化学稳定性， 表面形态和孔隙结构的不同有所差异。该过程类似体内骨再生过程的初始阶段。 吉姆萨染色是一种非常稳定和简便的染色方法。 从吉姆萨染色的多孔生物活性陶瓷的横截面测量的有效细胞的最长直线迁移距离很好地反映了细 胞在体内的迁移情况。 5试验样品 5.1形状和尺寸 试验样品的形状应为直径（10士0.2)mm，厚度（2士0.1)mm的圆片状。 5.2试验样品数量 采用至少5片对照样品和5片试验样品进行比较。 5.3对照材料 经过基础研究和/或临床结果证实为良好骨填充物的已上市多孔生物活性陶瓷。推荐使用已在多 个国家上市的对照材料，或者检查结果证实具有该性能的标准品。 2 YY/T 1744—2020 6试验步骤 6.1试验样品厚度和直径的测量 应用卡尺或微米尺测量试验样品的厚度和直径。 6.2试验样品灭菌 在试验前用不影响材料质量的方法对试验样品进行灭菌。 6.3试验样品脱气 将试验样品浸人装有5mL完全培养基的密封离心管中。用连接20mL注射器的18～21号针头 刺人试管盖后，将注射器的芯杆活塞完全拉回到基准线并保持2min3min，以消除气泡。 6.4细胞培养 将成骨样细胞接种于6孔板或直径35mm细胞培养皿中，培养至完全汇合。推荐使用MG-63或 MC3T3-E1成骨样细胞。为了使细胞在6孔培养板中3d内增殖至完全汇合，每孔接种MG-63， 6.0×10*个或MC3T3-E1，8.0×10*个。在接种2d～3d后，应在相差显微镜下观察细胞，以检查细胞 汇合情况并避免细胞过度汇合。 注：参考ISO13366-1:2008或者ASTMF2149-01中表述的细胞计数方法对细胞数量计数。 若使用非本标准推荐的细胞系进行试验时，应先通过预试验确认细胞接种数量，确保细胞于3d内 达到汇合状态。 当孔（血)中细胞完全汇合时，取3个孔（血）使用吉姆萨染色，用于记录迁移试验前的细胞汇合状 态，具体方法如下：用2%戊二醛固定过夜后，每孔（血）加人2.5mL适当浓度的吉姆萨溶液（使用PBS 溶液稀释），并于室温下孵育3min。然后去除染色液，使用2.5mL蒸馏水清洗3次。每个孔（血）的立 体显微照片应在10倍或最大可用放大倍数下拍摄，以便在相同的范围内观察孔或血的底部。 6.5在细胞层上放置样品 理后的样品，并于上方放置一个外径为10mm，线径为0.8mm～1.0mm的SUS316不锈钢（相当于我 国的0Cr17Ni12Mo2不锈钢）双环（如图2所示）固定样品。两者均应使用镊子轻放，避免直接落人培养 基或搅动培养基。因为制造过程的因素，样品表面可能有一些粗糙和不平整，应使用光滑面放置于细胞 层上。 将培养板（或血)转移到CO2培养箱中时，注意不要造成样品位移，因为这样