ICS_11.040.30 YY C 30 中华人民共和国医药行业标准 YY/T 1695—2020 人类辅助生殖技术用医疗器械 培养用液中氨基酸检测方法 Medical devices forhuman assisted reproductivetechnology- Determination of amino acids inhuman assisted reproductive media 2020-03-31发布 2021-04-01实施 国家药品监督管理局 发布 YY/T1695—2020 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家药品监督管理局提出。 本标准由中国食品药品检定研究院归口。 本标准起草单位：中国食品药品检定研究院。 本标准主要起草人：柯林楠、黄元礼、赵丹妹、方玉、韩倩倩、王春仁、段晓杰。 YY/T1695—2020 人类辅助生殖技术用医疗器械 培养用液中氨基酸检测方法 1范围 本标准规定了用氨基酸分析仪法、高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪法、高效液相色谱柱前衍生 法检测人类辅助生殖技术用培养用液中氨基酸成分。 本标准适用于人类辅助生殖技术用培养用液中所含甘氨酸（GLY）、亮氨酸（LEU)、蛋氨酸 （MET)、酪氨酸（TYR）、组氨酸（HIS）、苏氨酸（THR）、丙氨酸（ALA）、异亮氨酸（ILE）、色氨酸 (TRY)、胱氨酸(CYS)、赖氨酸（LYS)、天门冬氨酸（ASP）、缬氨酸（VAL）、苯丙氨酸（PHE)、脯氨酸 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 JG1064一2011氨基酸分析仪检定规程 YY/T0995人类辅助生殖技术用医疗器械术语和定义 3术语和定义 YY/T0995界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 氨基酸分析仪法aminoacidanalyzer 氨基酸分析仪中离子交换色谱柱将样品中不同的氨基酸分离，并以三酮做柱后衍生后，在 570nm和440nm波长下测定，以外标法进行定量。 3.2 dem mass spectrometry 高效液相色谱将样品中的待测成分初步分离开，三重四级杆质谱仪对分开的待测成分通过筛选母 离子质核比得到待测离子，待测离子经碰撞后碎裂成子离子，最后通过子离子的碎片强度定量待测 成分。 3.3 analysis method 待测组分先通过衍生化反应，转化为衍生化产物，然后经过色谱柱与样品中的其他组分分离，再通 过外标法进行定量。 1 YY/T1695—2020 4方法一：氨基酸分析仪法（仲裁法） 4.1原理 不同氨基酸有不同的色谱表现，通过氨基酸分析仪的离子交换色谱柱分离后，以三酮做柱后衍生 后进行测定，以外标法定量。 注：氨基酸分析仪法测定含有二肽，如丙氨酰-谷氨酰胺等培养用液时，胱氨酸(CYS)定量会受到培养用液中二肽的 干扰，不适宜采用该法。 4.2试剂 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 4.2.1不同pH和离子强度的洗脱用柠檬酸锂缓冲液：按仪器使用说明书配制或购买。 4.2.2节三酮溶液：按仪器使用说明书配制或购买。 4.2.34%磺基水杨酸溶液：称取磺基水杨酸4g，加水稀释至100mL。 4.2.4 0.1mol/L盐酸溶液：取盐酸9mL，加水适量使成1000mL，摇匀。 4.2.5 0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，加新沸过的冷水使成1000mL，摇匀。 4.2.619种氨基酸对照品：国家（或国际）标准品或可量值溯源的对照品。 4.3对照品溶液配制 4.3.1氨基酸对照品储备液 分别取氨基酸对照品适量至容量瓶中，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液溶解并定容至刻度，制成 氨基酸对照品储备液。称取L-色氨酸对照品适量至容量瓶中，精密称定，加少许水和数滴0.1mol/L氢 氧化钠，使之溶解，加水定容至刻度。 4.3.2混合氨基酸对照品系列溶液 吸取单个氨基酸对照品储备液适量，置于同一容量瓶中，加水稀释配制成混合氨基酸对照品储备液。 将混合氨基酸对照品储备液稀释，配制成混合氨基酸对照品系列溶液，使各氨基酸浓度在1ug/mL～ 100μg/mL范围。4℃冰箱保存一周。 4.4仪器 4.4.1电子天平，精度为0.0001g。 4.4.2氨基酸分析仪。 4.4.3高速离心机。 4.4.4涡旋振荡器。 4.5 试样制备 精密移取一定量样品，加水稀释至各氨基酸浓度在1μg/mL～100μg/mL范围。 样品中如含有蛋白质，取样品0.5mL，加0.5mL4%磺基水杨酸，混匀后，9500g离心10min，取 上清液备用。若上清液中各氨基酸浓度不在1μg/mL100μg/mL范围，应用水将浓度稀释至该 范围。 4.6 分析步骤 4.6.1仪器调试 使用混合氨基酸对照品系列溶液注人氨基酸分析仪，参照JJG1064一2011《氨基酸分析仪检定规 2 YY/T1695—2020 程》及仪器说明书，适当调整仪器操作程序及参数和洗脱用缓冲溶液试剂配比，确认仪器操作条件。 4.6.2测试 在上述测试条件下，取混合氨基酸对照品系列溶液和样品溶液（或供试液)20μL，分别注入氨基酸 分析仪，以各氨基酸对照品峰面积为纵坐标，氨基酸对照品浓度为横坐标，绘制各氨基酸标准曲线，计 算回归方程。 4.7 结果计算与表示 4.7.1样品中各氨基酸含量 样品中各氨基酸含量按式（1)计算： X,=C,XK (1 ) 式中： X，——样品中氨基酸i含量，单位为微克每毫升（μg/mL)； C；一一根据回归方程计算样品测定液中氨基酸i含量，单位为微克每毫升（μg/mL)； K试样稀释倍数。 4.7.2结果表示 以两个平行试样测定结果的算术平均值报告结果。 4.8质量控制 4.8.1分离度 各氨基酸分离度≥85%。 4.8.2空白分析 每次分析至少做一个实验室空白，实验室空白中检出每个目标化合物的浓度不得超过方法的检 出限。 4.8.3校准 每批样品应绘制标准曲线，相关系数应≥0.995，否则应重新绘制标准曲线。 每20个样品或每批次样品（少于20个样品）应测定一个标准曲线中间浓度点标准溶液，其测定结 果与该点浓度的相对偏差应≤15%，否则应重新绘制标准曲线。 4.8.4平行样测试 每个样品需做平行双样，平行双样测定结果的相对偏差应≤15%。 5方法二：高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪法 5.1原理 通过乙腈沉淀人类辅助生殖技术用培养用液中的蛋白质，离心取得上清液后，通过高效液相色谱串 联三重四极杆质谱仪分离检测，根据保留时间及特征离子质核比定性，外标法定量。 3 YY/T1695—2020 5.2试剂 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 5.2.1乙腈，色谱纯。 5.2.2甲酸，色谱纯。 5.2.30.1mol/L盐酸溶液：取盐酸9mL，加水适量使成1000mL，摇匀。 5.2.40.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，加新沸过的冷水使成1000mL，摇匀。 5.2.519种氨基酸对照品：国家（或国际）标准品或可量值溯源的对照品。 5.3 氨基酸对照品溶液配制 5.3.1氨基酸对照品储备液 分别取氨基酸对照品适量至容量瓶中，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液溶解并定容至刻度，制成 氨基酸对照品储备液。称取L-色氨酸对照品适量至容量瓶中，精密称定，加少许水和数滴0.1mol/L氢 氧化钠，使之溶解，加水定容至刻度。 5.3.2混合氨基酸对照品系列溶液 移取单个氨基酸对照品储备液适量，置于同一容量瓶中，加空白溶液（与待测样品基质相同，但不含 氨基酸及蛋白)稀释配制成混合氨基酸对照品储备液。将混合氨基酸对照品储备液空白溶液稀释，配制 成混合氨基酸对照品系列溶液，使各氨基酸浓度在0.05μg/mL～1μg/mL范围。 5.4仪器 5.4.1高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪，配电喷雾离子化源（ESI)。 5.4.2电子天平，精度为0.0001g。 5.4.3高速离心机。 5.4.4涡旋振荡器。 5.5试样制备 精密移取一定量样品，加水稀释至各氨基酸浓度在0.05μg/mL～1μg/mL范围。 样品中如含有蛋白质，取样品100μL，加200μL乙腈，涡旋混匀后，9500g离心10min，取上清液 备用。若上清液中各氨基酸浓度不在0.05μg/mL1μg/mL范围，应用水将浓度稀释至该范围。 5.6分析步骤 5.6.1仪器参考条件 5.6.1.1高效液相色谱仪参考条件 高效液相色谱仪参考条件如下： a) 色谱柱：填料为3μm五氟苯基柱，柱长150mm、内径2.1mm的色谱柱或其他性能相似的色 谱柱。 b) 流动相：A为100%水（含0.1%甲酸溶液）；B为100%乙腈（含0.1%甲酸溶液）。 c) 流速：0.35mL/min。 d) 柱温：40℃。 e) 进样量：1.0μL。 4 YY/T1695—2020 f) 梯度洗脱程序见表1。 表1 流动相梯度洗脱程序 时间/min 流动相B比例/% 1.4 3.5 25 7.5 35 8.0 95 11.0 95 11.5 。 14.0 停止 对不同色谱柱及液相，洗脱程序可能存在差异，测定前宜将程序优化到最佳。 5.6.1.2 质谱仪参考条件 质谱仪参考条件如下： a) 离子源：