ICS11.040.30 YY C 30 中华人民共和国医药行业标准 YY/T1688—2021 人类辅助生殖技术用医疗器械 囊胚细胞染色和计数方法 Medical devices for human assisted reproductive technology- A method for blastocyst cell staining and counting 2021-03-09发布 2022-04-01实施 国家药品监督管理局 发布 中华人民共和国医药 行业标准 人类辅助生殖技术用医疗器械 囊胚细胞染色和计数方法 YY/T1688—2021 * 中国标准出版社出版发行 北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029） 北京市西城区三里河北街16号（100045) 网址www.spc.net.cn 总编室：(010)68533533发行中心：(010)51780238 读者服务部：(010)68523946 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 各地新华书店经销 * 开本880×1230 1/16 印张0.5字数10千字 2021年3月第一版 2021年3月第一次印刷 * 书号：155066·2-34569定价 16.00元 如有印装差错 由本社发行中心调换 版权专有 侵权必究 举报电话：(010)68510107 YY/T1688—2021 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家药品监督管理局提出。 本标准由中国食品药品检定研究院归口。 本标准起草单位：中国食品药品检定研究院、南京优而生物科技发展有限公司、中国科学院遗传与 发育生物学研究所。 本标准主要起草人：韩倩倩、金星亮、尹艳云、王迎、方玉、王春仁。 YY/T1688—2021 人类辅助生殖技术用医疗器械 囊胚细胞染色和计数方法 1范围 本标准规定了对小鼠囊胚细胞进行染色和计数的试验方法。 本标准适用于与配子和/或胚胎直接或间接接触的人类辅助生殖技术用医疗器械的安全性评价。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 YY/T0995人类辅助生殖技术用医疗器械术语和定义 YY/T1434人类体外辅助生殖技术用医疗器械体外鼠胚试验 3术语、定义和缩略语 3 下列术语和定义适用于本文件。 3.1术语、定义 YY/T0995和YY/T1434界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 扩张囊胚expandedblastocyst 囊胚腔已充分扩展，透明带变薄的囊胚。 3.1.2 孵化囊胚hatchingorhatchedblastocyst 囊胚细胞部分或全部从透明带中逸出的囊胚。 3.1.3 内细胞团 innercell mass 囊胚内层的一个细胞群，成团状分布，最终主要发育成胎儿。 3.1.4 滋养层细胞trophectodermcell 囊胚外层细胞，最终主要发育成胎盘。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersaline） Hoechst33342：双苯酰亚胺（bisbenzimide） PFA：多聚甲醛（paraformaldehyde) BSA：牛血清白蛋白（bovineserumalbumin） YY/T1688—2021 UTF1：未分化的胚胎细胞转录因子1（theundifferentiatedembryoniccelltranscriptionfactor1） NANOG:(nanoghomeobox) DABCO:(1,4-diazabicyclo[2.2.2]octanesolution) DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleotideacid) PI：碘化丙啶（propidiumiodine） DAPI:4，6-联滕-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole） 4试验方法 4.1概述 囊胚期胚胎细胞主要包括内细胞团细胞和滋养层细胞。本试验利用DNA染色试剂与细胞核结 合，对囊胚细胞进行染色，在荧光显微镜下观察，从而确定囊胚细胞总数。通过免疫荧光染色对内细胞 团细胞表达的标记物进行染色，确定内细胞团细胞数。本标准中室温系指20℃～25℃。 注：anti-UTF1抗体、anti-NANOG抗体或其他经验证的抗体可用于内细胞团染色。 4.2 2试剂 试剂如下： a） 胚胎漂洗液：PBS(pH7.2~pH7.4)或其他。 b) DNA染色试剂：Hoechst33342，DAPI,PI或其他。 c) 固定液：2%PFA或其他常用固定液。 (P 封闭液：30%与二级抗体同源的血清。 e) 抗体缓冲液：含2%BSA的PBS缓冲液或其他。 初级抗体：anti-UTF1抗体或anti-NANOG抗体或能特异性识别内细胞团细胞的抗体。 g) h) 二级抗体：偶联荧光素并与初级抗体特异性结合的抗体。 i) 封片剂：凡士林或其他。 j) 抗淬灭剂：DABCO或其他。 4.3耗材 耗材如下： a）眼科镊。 b）载玻片。 c）盖玻片。 d)培养皿。 4.4仪器 仪器如下： a）体视显微镜。 b）荧光显微镜。 4.5 5试验过程 4.5.1囊胚收集 按照YY/T1434进行囊胚培养，收集供试样品组和阴性对照组所有发育良好的囊胚，包括扩张囊 2 YY/T1688—2021 胚和孵化囊胚。 4.5.2 染色及计数程序 染色及计数程序如下： a）室温下，用PBS漂洗囊胚3次，放人2%PFA中固定30min； b) 将囊胚转移至透膜液中，室温下30min； c) PBS漂洗囊胚3次，每次10min； d) 囊胚置于30%的动物血清（与二抗同源)1h～3h，以封闭非特异性的抗体结合位点；PBS漂洗 囊胚1次。 (a 4℃下与初级抗体结合12h； f) PBS漂洗囊胚3次，每次10min； g) 室温、避光条件下与二级抗体结合1h； h) PBS漂洗囊胚3次，每次10min； 根据二级抗体所联结的荧光色谱，将胚胎移至合适的DNA染色液（如Hoechst33342染色液 或PI等）中，室温避光条件下30min； 制片：取抗淬灭剂DABCO滴于载玻片上，将囊胚置于DABCO液滴中，液滴四周以凡士林支 j) 撑，将盖玻片轻轻压到液滴上，与凡士林接触后适当加压，使囊胚充分延展； k) 置于室温避光条件下20min； 荧光显微镜下直接计数或根据染色囊胚的照片进行计数，初级抗体染色的细胞为内细胞团细 胞，DNA染色的细胞为囊胚总细胞。 注：本部分描述为通用操作步骤，可采用商品化的免疫荧光试剂盒完成。 4.6 结果分析 4.6.1囊胚质量判断 发育良好的囊胚总细胞数≥50个，内细胞团细胞数12个。 4.6.2 结果统计 收集供试样品组和阴性对照组所有囊胚，每组样本量不少于30个囊胚，进行统计学分析。 4.7 试验报告内容 试验报告应包含如下信息： a) 供试品信息和对照品信息； b) 试验动物信息； 试验条件； P 试验步骤； 试验结果； f) 试验结论。 YY/T 1688—2021 YY/T1688—2021 参考文献 [1]GaneshanL,JinXL,O'NeillC.The induction of tumour suppressor proteinP53limits the entry of cells into the pluripotent inner cell mass lineage in the mouse embryo.Exp Cell Res.2017 Sep 15;358(2):227-233. [2]PfefferPL.BuildingPrinciples for Constructing aMammalianBlastocystEmbryo.Biology (Basel).2018Jul23;7(3). [3]Wigger M,Kisielewska K,FilimonowK,Plusa B,Maleszewski M,Suwinska A.Plasticity of the inner cell mass inmouse blastocyst is restricted by the activity of FGF/MAPK pathway.SciRep. 2017Nov9;7(1):15136. [4]Jin XL,O'Neill C.Systematic analysis of the factors that adversely affect the rate of cell ac- cumulation in mouse embryos during their culture in vitro.Reprod Biol Endocrinol.2014 May 8; 1235. 版权专有侵权必究 * 书号：155066·2-34569 YY/T1688-2021 定价 16.00元