ICS11.040.40 YY C 45 中华人民共和国医药行业标准 YY/T1561—2017 组织工程医疗器械产品 动物源性支架材料残留α-Gal抗原检测 Tissue engineering medical device products- Remnant aα-Gal antigen determination in scaffold materials utilizing animal tissues and their dcrivatives 2017-03-28发布 2018-04-01实施 国家食品药品监督管理总局 发布 YY/T 1561—2017 前 言 本标准按照GB/1.1一2009给山的规则起卓 请注意本文的菜些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承扣识别这些专利的贡任。 本标准由国家食品药品监督管理总局提山 本标准山企国外科植入物利矫形器械标准化技术委员会组织工程医疗器械产品分技术委员会 (SAC/TC110/SC3)归口 本标准起单位：中国食品药品检定研究院、国人民懈放军第四牢医人学、冠员生物科技股份行 限公司 本标准士要起草人：徐丽明、邵姿良、附艳、赵红妮、金光、张勇杰、汤银喜、张伟、柴媛 1 YY/T1561—2017 引言 器它移枯中超急性免疫排斥反应及慢性免疫毒性的主要内素。尽管动物源性生物材料在制备过程中经 过了脱细胞和去除抗原的处理.仙残留的异种抗原仍存在若导致慢性免疫毒性反成的风险 L有例究显示α-半乳耕基抗原（αl，3galactosylc，Alphal，3Gal或αGal）是引起动物源性生物材料 或异种器穴移植时超急性免疫排斥反应的主要靶抗原。α-Gal的结构为Galα1-3Gal1-4Glc\Ac-R， 该抗原是乳糖基与细胞脱上的蛋'I或脂结合构成的·组完全性抗原。α-Gali要受α-1.3半乳糖基 转移悔（αl，3galactosyltransfcrasc，aGT）及异红细胞升脂个成悔（isoglobotriosylccramidesynthasc 或isogloboside3synthase，iGb3S）调控，由丁人休体及类人狼、古Ⅲ纪猴的半乳糖H转移酶基因有2个 碱基错位变异而不表达α（Gal抗原：但人肠道菌群持续表达α（Gal抗原：这种刺激致使人体免疫系统持 或异种器官移植时会引起超急性免疫排斥反应及慢性的免疫毒性反应。动物源性生物材料或异种器官 移植中α-Gal抗原的去除成为降低免疫排斥反应和慢性免疫毒性反应的关键之一。日前尚无动物源 :生物材料残留α-Gal抗原的定量检测方法，本标准通过使用α-Gal抗原特异性:单克降抗休M86， 抑方法定量检测动物源性牛物材料残留的α-Gal抗原。同时，试验休系川人了Gal抗原阳性和 阴性参考品，使试验的灵敏性和特异性得以监择 竞争性ELISA抑制方法是一常而的方法，只原理是：Y先将标准曲线样品及试验样品的-Ga 抗原与M86抗体反应（消耗部分M86抗体）；然后用GaIBSA作为固相抗原，通过ELISA方法检测第 一次反应后上清液中的剩余M86抗体；进而可利而标准曲线计算待测物中的α-Gal抗原含量。由丁第 次待测物的α-Gal抗原与M86抗体的反应对后续的剩余M86抗体与固机IGal-BS^抗原的反应构 成了抑制效应，故称为ELISA抑制法 YY/T1561—2017 组织工程医疗器械产品 动物源性支架材料残留α-Gal抗原检测 1范围 本标准给山了组织1程医疗器械产品支架材料制务时川的动物源性!物材料中残留α-Gal抗原 的定量检测方法。 本标准适用丁制备纠织1程医疗器械产品支架材料的各种动物米源的牛物材料或其衍牛物的 α-Gal抗原检测。 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注期的引用文件，仅注1期的版不适用于不义 件。凡是不注Ⅱ期的用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/二16886.20医疗器械生物学评价第20部分：医疗器械免疫毒理学试验原则与方法 (GB/T16886.20—2015,ISO/TS10993-20:2006,IDT) YY/0606.25组织1程医疗产品第25部分：动物源性牛物材料DVA残留量测定法：荧光染 色 3术语和定义 4试剂和仪器 4.1试剂 试剂包括： a） 磷酸盐缓冲液（PBS，phosphatcbufferedsalinc，pII7.4) b) 碳酸盐缓冲液（pH9.5）； 市售α-GalEpitope(Galα1-3Galβ1-+GleNAc-R）.mAb(M86），分装后20C保存； () d）市售Galα1-3gal-BSA（3atomspacer，简称Gal-BSA）.济丁去离了水中，分装后 20保存 备用： e) 辣根酶标记的山丫抗小鼠二抗（IgM-HRP） f) MB(3,3.5.5-etramethylbenzidine）显色液； g) 血清蛋； h） 浓度）脱氧胆酸盘（sodiumdeoxycholate），0.1%（质量浓度）十二烷基硫酸钠（SID)S），原钒酸钠 （sodiumorthovanadate）.氟化钠（sodiumfluoride），乙.：胺四乙酸（EDA），亮抑酶肽 T YY/T1561—2017 （leupeptin）及苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonylfluoride，PMSF）； i) 洗液：0.05%（体积分数）的吐温-20/PBS； j）10"（体积分数)H.SO； k)( Gal抗原阳性牛物材料参考品； 1）Gal抗原阴性生物材料参考品。 4.2 2仪器 仪器包括： a）37%温床； b） 酶标仪； c) 冷冻离心机； d) 震荡器； 高精度人平（0.0001g）； 勾浆仪； g）移液枪； h)pll i。 5 试验步骤 5.1 样品准备 5.1.1 试验样品 精确称取试验样品（2mg～10mg）置于2.0mL或5mL无菌离心答内；若为固态块状或片状试 验样品，则用无菌眼科剪将样品剪裁成细小碎块，液态或粉末状试验样品无需特殊处理；加人裂解液（可 使用市售品）配制成样品浓度为2mg/mL10mg/mL[使用前加人1%（体积分数）1mmol/LPMSF， 为操作方使推荐至少每份样品配制2ml,的裂解液1.低温匀浆2min～10min，至样品全部粉碎，形成 均匀组织匀浆；率温（25%5%）放置30min~3h.至样品企部裂解（肉眼观察无明显固态物质存作）， 离心（3000r/min~5000r/min）取.1清备用。 注1：每份样品设平行样3份，最终测定结果收H平均值一SD， 注2：可以根据委托方的要求，取不同批号或同一批号的样品3份川以评价不同批次或同一批次内的1艺稳定性。 5.1.2标准曲线样品 精确称取Gal抗原阿性生物材料参考品（冻粉）样品2mg.置-」2mL或5mL元菌离心管内.加 入裂解液二使用前加人1%（体积分数)1mmol/LPMSF］配制成样品浓度为2mgmL，含Galα1-3gal- 上清液，用裂解液进行倍比梯度浓度稀释，得到最少不低于5个Galα1-3gal-BSA系列稀释浓度的稀释 液，用于做标准曲线。为得到每次试验的低检测限：应稀释到检测OD值与Ga抗原阴性参考品检测 OD）俏和等或利近的浓度，从而确定其上·个浓度为本次试验的最低检测限 OD值在标准Ⅲ线范用内。 5.1.3Gal抗原阳性和Gal抗原阴性参考品样品 分别精确称取2mgGal抗原阳性和阴性参考品（冻干粉），放丁2ml.或5ml.尤菌离心管内.川入 2 YY/T1561—2017 30min~3h至样品企部裂解；将裂解后样品进行离心后取上清液备用。 5.1.4对照孔样品 设定M86/Gal抗原性生物材料参考品裂解液反应样品1份作为100%的反应值；裂解液反应样 品1份作为背景值， 5.2M86抗体孵育 5.1中每个样品分别取200μL置于1ml离心管中.标记，每管分别加人等休积(200叫L)稀释比例 为1：100～1：200的M86抗体溶液（应保证M86抗体是过量的，可通过预实验确认）。混匀后在空温 （25℃十5℃）温和摇动（如：100r/min）条件下反应2h.之后置」1℃孵育过夜。次日.在离心速度为 14000g，+条件下离心30min后取上清液备， 注：四M85无一种非纯化的抗体，不同批次之问的活性可能行在差异。建议在新试剂使用前先确认抗体活性与既 往使批次见否有差异，必要时重新验证抗体稀释比例的合理性。 5.3ELISA抑制法检测上清液中剩余M86抗体 5.3.1固相抗原包被板的制备 首先用去离了水将Galα13galBSA（如：5001g/mlGalBSA）稀释一定倍数（如：25倍），再用 pH9.5的碳酸盐缓冲液再次稀释（如：10倍），制备2ug/mLGalαl3galBSA稀释溶液。取100μL/孔， 川入悔标板，泥匀后在究温温和摇动2h，之后置于4℃孵分过夜进行包被，次日用洗液（0.05°。的吐 温-20/PBS)洗板至少3次（伴随温和播动，100r/min），在吸水纸上拍于。川人1/（质量浓度）的血清 白200L/孔进行封闭，置于37℃，2h，伴随温和摇动。之后再次洗板扩1备用， 注1：一次制备的Galel3galBSA包被板可」4C密封保存，一周内使而 注2：配制碳酸盐缓冲液：称取凝钠0.3562g，碳酸氢钠0.8401g-而约0mlL超纯水溶解，在pII仪下调整至pII 为9.5.定容至100ml 5.3.2剩余M86抗体检测 分别取100叫L5.2中准备的试验样品与M86抗体反成后的反成物1清液