ICS 11.040.30 YY C 30 中华人民共和国医药行业标准 YY/T15322017 医疗器械生物学评价 纳米材料 溶血试验 Biological evaluation of medical devices-Nanomaterials-Hemolysis test 2017-03-28 发布 2018-04-01实施 国家食品药品监督管理总局 发布 YY/T1532—2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家食品药品监督管理总局提出。 本标准由中国食品药品检定研究院归口。 本标准起草单位：中国食品药品检定研究院、国家食品药品监督管理局广州医疗器械质量监督检验 中心。 本标准主要起草人：邵安良、徐丽明、杨立峰、柯军、郭欢、杨文润、许建霞。 YY/T1532-—2017 医疗器械生物学评价 纳米材料 溶血试验 1范围 本标准规定了直接/间接与血液接触的纳米材料及组合在医疗器械中纳米材料的溶血性能试验 方法。 本标准适用于直接/间接与血液接触的纳米材料及组合在医疗器械中游离或释放的纳米材料的溶 血性能评价。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验（GB/T16886.1-一 2011,ISO10993-1:2009,IDT) GB/T16886.4医疗器械生物学评价第4部分：与血液相互作用试验选择（GB/T16886.4- 2003,ISO10993-4:2002,IDT) GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品（GB/T16886.12一 2005,ISO10993-12:2002,IDT) 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 GB/T16886.1、GB/T16886.4中界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 高铁血红蛋白 methemoglobin 铁原子已被氧化成高铁离子的血红蛋白。 3.1.2 氰化高铁血红蛋白cyanmethemoglobin 铁原子被氧化成高铁离子，高铁离子已同氰离子相结合的血红蛋白。 3.1.3 总血红蛋白 totalbloodhemoglobin 正常存在于人循环血液中的所有血红蛋白衍生物，包括脱氧血红蛋白、氧合血红蛋白、硫化血红蛋 白、碳氧血红蛋白和高铁血红蛋白。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Cal：校准标准品（Calibrationstandard) CMH：氰化高铁血红蛋白（Cyanmethemoglobin） DPBS：不含钙镁的杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbercco'sPhosphateBufferedSaline） 1 YY/T1532—2017 PEG：聚乙二醇（PolyethyleneGlycol） PFH：血浆游离血红蛋白（PlasmaFreeHemoglobin) QC：质量控制品（QualityControls） TBH：总血红蛋白(TotalBloodHemoglobin) 4总则 4.1本方法描述了直接/间接与血液接触的纳米材料及组合在医疗器械中游离或释放的纳米材料引起 的急性体外红细胞破坏（即溶血）的试验方案。本方法的原理是除硫化血红蛋白外，血红蛋白及其衍生 物在碱性条件下可被高铁氟化钾氧化成高铁血红蛋白，高铁血红蛋白与氟化钾反应生成CMH，采用微 孔板分光光度计（或酶标仪)在540nm波长处读数测定CMH吸光度值。结果用纳米材料与血液接触 后释放到血浆中的PFH占TBH的百分比来表示。 4.2试验样品可选用纳米材料或组合有纳米材料的复合产品的浸提液。在试验前宜先对样品进行充 分的物理、化学表征，以便合理地解释生物学反应。例如颗粒的大小、比表面积和化学特性等会引起不 同的试验结果。每次试验应包括阳性对照和阴性对照。 5试剂、耗材及设备 5.1试剂 血红蛋白氧化剂(CMH试剂）、Cal、DPBS、PEG、TRITONX-100。 5.2耗材 96孔板、试管、枪头。 5.3设备 微孔板分光光度计（或酶标仪）、离心机、恒温水浴槽、加样器。 6样品制备 6.1纳米材料 将纳米材料样品直接稀释于DPBS中，制备不同浓度的稀释液，至少4个浓度。 注1：所选择浓度宜包括溶血率为5%时的浓度， 注2：若已知纳米材料的最终应用浓度，宜以9倍该浓度作为供试品。 6.2复合产品中的纳米材料 按照GB/T16886.12规定的浸提比例制备供试品。 注：必要时宜对供试品中的纳米材料进行表征，如纳米颗粒的浓度、粒径大小等。 7Cal、QC、对照及血液样品的制备 7.1Cal的制备 以Cal作为贮备液，然后采用CMH试剂作为介质，进行1：2倍稀释得到系列校准标准品，标准曲 2 YY/T1532—2017 线的吸光度值应包括样品和对照品的吸光度值（示例参见附录A）。 7.2QC的制备 QC的配制参见校准标准品，包括高、中、低3个浓度，这3个浓度应在校准标准品范围内，且与校 准标准品的系列浓度不重复（示例参见附录A）。 7.3阳性对照的制备 配制10%TRITONX-100水溶液作为阳性对照。 注：也可选用1%多聚-L-赖氨氮酸氢漠酸盐水溶液，但宜经验证。 7.4阴性对照的制备 配制40%PEG(平均分子质量为8000g/mol)贮存原液作为阴性对照，储存在4℃士3℃。 7.5血液样品的制备 收集成年健康家免的新鲜抗凝全血5mL（采用3.8%柠檬酸三钠溶液1：9稀释）于试管中，取其中 2mL~3mL血液，800g离心15min，收集上清液，室温放置。 8血液样本合格判定一一血液样本中PFH和TBH的测定 6孔。 8.3PFH样本加样：向每孔加人6.5中制备的100μL血浆，共6孔，再加人100μLCMH试剂。 8.4将96孔板密封后，置于平板振荡器上轻轻振荡1min～2min（中速，可设定为2档～3档，如 250次/min）。 8.5于540nm波长处读取各孔吸光度值，然后根据标准曲线回归方程[见式（1)计算得到PFH和 TBH的浓度。PFH样本的最终浓度要乘以稀释因子2；TBH样本的最终浓度要乘以稀释因子251。 若PFH浓度低于1mg/mL，继续下一个试验步骤；若高于1mg/mL，则当前血液样本不适合检测，需 重新采血。 9试验材料与血液的接触方式 9.1采用DPBS稀释全血，将8.5中TBH浓度调整至10mg/mL士1mg/mL。 9.2纳米材料：取100μL试验样品（见6.1)至试管中。每一试验样品制备6管，其中3管用于空白对 照。向每管中加入700μLDPBS。 9.3复合产品中的纳米材料：取800μL试验样品（见6.2）至试管中。每一试验样品制备6管，其中 3管用于空白对照。 9.4对照样品：取100μL阳性对照（见7.3)和阴性对照（见7.4）至试管中。每一样品制备各2管。向 每管中加人700μLDPBS。 9.5向试验样品组的空白对照3管内加人100μLDPBS，作为“阴性血样”对照，用于评价纳米材料对 方法的潜在干扰；其余每管中加入100μL步骤9.1中制备的稀释全血。 9.6盖紧试管，轻轻转动混合。每隔30min观察试验样品在试验过程中是否有絮结、分散、下沉或 悬浮。 注：涡旋可能会破坏红细胞，宜尽量避免。