ICS11.120.20 YY C 30 中华人民共和国医药行业标准 YY/T 1500—2016 医疗器械热原试验 单核细胞激活试验 人全血 ELISA 法 Pyrogentestfor medical devices-Monocyte-activation test- Human whole blood ELISA method 2016-07-29 发布 2017-06-01实施 国家食品药品监督管理总局 发布 YY/T15002016 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准是在参考了欧洲药典7.0单核细胞激活试验的基础上，结合医疗器械产品的特点制定。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家食品药品监督管理总局提出。 本标准由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会（SAC/TC248）归口。 本标准起草单位：山东恒信检测技术开发中心、中国医学科学院输血研究所、上海松力生物技术有 限公司。 本标准主要起草人：范春光、王红、孙立魁、刘嘉馨、何红兵、吴旭君。 H YY/T1500—2016 引言 热原检测是医疗器械生物学安全评价中的重要项目。医疗器械热原反应主要分为内毒素介导的热 原反应和非内毒素介导的热原反应。 致热原分为外致热原和内致热原。常见的致热原多为外致热原，外致热原进入人体后可激活体内 单核细胞、巨噬细胞等，使其产生白细胞介素1β(IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNFα） 等内致热原。内致热原可通过血-脑屏障直接作用于体温调节中枢使体温调定点上移，机体产热增多， 散热减少，从而引起发热。 单核细胞激活试验（MAT)用于对能激活人单核细胞或单个核细胞使其释放出诸如促炎性细胞因 子、IL-1β、IL-6和TNF-α之类的内源性介质的物质进行检测或定量。而这些细胞因子会导致发热性病 症。因此，MAT可检测出试验样本中存在的热原。本标准在附录A中给出了单核细胞激活试验指南。 2009年，欧洲药典收录了体外热原检查法，美国FDA也接受了5种基于人免疫细胞的注射用药热 原体外试验法。这些方法采用人全血、成分血或细胞系等为细胞源，检测其与受试物接触孵育后产生的 IL-1β，IL-6和TNF-α等内致热原。国际标准化组织技术委员会（ISO/TC194）的16工作组一份文件 表述到，IL-6、IL-1β的检测具有较高的信噪比，是较好的细胞因子热原标志物。本标准在附录B中给出 了用于医疗器械热原检测的人全血IL-1β法示例。 Ⅱ YY/T1500—2016 医疗器械热原试验单核细胞激活试验 人全血ELISA法 1范围 本标准给出了用人全血ELISA法测定医疗器械/材料中致热原的试验方法。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品 3概述 医疗器械/材料与人全血接触后，医疗器械/材料中所含的致热原激活血液中的单核细胞，被激活的 单核细胞可产生内致热原，如IL-1β、IL-6和TNFα等。通过ELISA法测定接触后全血中内致热原的 量，并将单核细胞对供试品的反应和对内毒素标准品的反应进行比较，间接反映出医疗器械/材料中所 含的热原物质的量。 4全血来源和质量要求 4.1全血 全血应符合4.2和4.3要求的混合全血。 4.2献血者的质量要求 献血者要在符合有关知情、健康、安全以及伦理相关强制性要求的前提下满足下列合格准则。供献 血者要自述健康状况良好，并在献血前至少1周无细菌或病毒感症状。献血者在献血前48h内没有服 用过非留体类抗炎药物，并在献血前7d内没有服用备体类抗炎药物。服用过免疫抑制剂或其他已知 能影响读取对象的药物的人不宜作为献血者。献血应根据国家输血要求检验血液感染标志物。 4.3混合全血的质量要求 混合全血应来自于至少4名献血者，如可行，最好是8名或更多献血者，从每一供血者取大约等体 积的血液。质量要求如下：采血后4h内，用其对标准内毒素几何稀释的至少4个浓度的内毒素溶液 （如在0.01IU/mL～4IU/mL的浓度范围内）绘制剂量-反应曲线。该剂量-反应曲线应满足7.2中所 述的标准曲线的2个准则。 5器具 用一个确认过的过程在干热烤箱中将所有玻璃器具和其他耐热器具除热原。通常使用的时间和温 1 YY/T1500-—2016 度为250℃至少持续30min。若使用塑料器具，如微孔板和微量加样器配套的吸头等，应使用标明无 可检测热原并且对该试验无干扰的器具。 6样品制备 6.1液体、凝胶、角膜接触镜和冠脉支架等小型器械推荐采用直接接触法。 6.2其他器械/材料置无热原玻璃器皿内，加入无菌无热原生理盐水，按GB/T16886.12的原则制备供 试液。 注：如采用浸提液法，使用者宜对所选用的浸提方法的适宜性进行确认。 7预试验 7.1总则 为确保该试验的精密度和有效性，应进行预试验，以确保：标准曲线接受准则得到满足（见7.2）；供 试品不会对试验有干扰（见7.3）；试验能检测内毒素污染物和非内毒素污染物（见7.4）。 7.2标准曲线接受准则的保证 用内毒素标准浴溶液制备至少4种内毒素浓度来得出标准曲线。内毒素标准溶液的每种浓度至少进 有两个可接受准则： 一剂量取log值后，反应的回归应有统计学意义（p<0.01）； 一一剂量取log值后，反应的回归不应与线性发生显著性偏离（p>0.05）。如果是对某一的四参数 logistic曲线进行分析，所观察的曲线不应显著偏离用常规统计方法计算得到的理论曲线。 7.3于扰因素试验 当可能影响试验结果的实验条件发生任何变化时，需要进行试验方法的确认。设置供试品组，同时 设置供试品加入标准曲线中点或其附近对应浓度内毒素组。使用标准曲线计算每一溶液中内毒素当量 浓度。从已加入内毒素的溶液中内毒素当量减去溶液中内毒素当量，来计算所加入内毒素的平均回收 率。如果在该试验条件下，加人内毒素供试液中测得的内毒素当量减去未加人内毒素供试液中测得的 任何内毒素当量后，在所加入内毒素浓度的50%～200%范围内，则该供试液被认为无干扰因素。 7.4非内毒素单核细胞激活物的方法确认 除了检测细菌内毒素外，本试验也适用于检测非内毒素促炎性或热原性污染物。当用于检测非内 毒素促炎性或热原性污染物时，可用已经证实有非内毒素污染物污染，并在家兔热原试验导致阳性反应 或在人体中产生药物热原副反应的历史批次来证实。当无法获得这些批次时，试验系统的确认宜包括 预试验，用不同的配体，如肽聚糖、脂磷壁酸或合成细菌脂蛋白与表达的各toll样受体（toll-like receptor，TLR)结合。 8试验程序 8.1试验方法 推荐使用直接接触法。若供试品为浸提液，使用确认过的试验方法，制备表1中的各溶液，并将每 2 YY/T1500—2016 种溶液用从至少4名献血者收集的全血进行3个平行培养。使用人全血ELISA试剂盒并按试剂盒说 明书规定测定各反应管上清液中促炎性细胞因子或热原性细胞因子的含量。 表1试验溶液制备 溶液编号 溶液 加人的内毒素/(IU/mL) 平行试验数量/个 A 供试液(f) 无 3 8 供试液(f) 标准内毒素曲线的中点剂量 3 Ro 无热原生理盐水 无(阴性对照) 3 R,-R, 无热原生理盐水 不同浓度的标准内毒素 每种浓度3 注1：溶液A一一供试溶液处于进行干扰因素试验时的稀释度（用f表示），即最高浓度（最小稀释度），该浓度的 内毒素的回收率在50%～200%范围内。 注2：溶液B一溶液A加入标准内毒素：标准内毒素曲线的中点剂量。 注3：溶液R。阴性对照。 注4：溶液R-R——内毒素标准品溶液，为在干扰试验中所使用的浓度，n≥4。 8.2 2结果计算和判定 数据分析中所需的所有数据与满足标准曲线的两个可接受准则的细胞相关。从溶液B中得到的 内毒素浓度减去溶液A中得到的内毒素浓度得到的内毒素的回收率，应在50%～200%的范围内。使 用内毒素标准品溶液R～R，曲线来计算溶液A的每一平行试验中内毒素浓度。如果稀释校正后的溶 液A中测得的每一平行试验中平均内毒素浓度均小于相应的内毒素限值，则供试品符合试验要求。 3