SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2564—2010 水产品中致病性弧菌检测 MPCR-DHPLC 法 Detection of pathogenic Vibrio in seafood- MPCR-DHPLC 行业标准信息服务平台 2010-05-27发布 2010-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2564—2010 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫 局、中华人民共和国西藏出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：郑秋月、曹际娟、徐君怡、于兵、郑晶、田苗、裴轶君、王金玲、于灵、王顺芝、王旭 行业标准信息服务平台 I SN/T2564—2010 水产品中致病性弧菌检测 MPCR-DHPLC 法 1范围 本标准规定了水产品中副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌5种致病性弧菌的 MPCR-DHPLC检测方法。 本标准适用于水产品中副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌5种致病性弧菌的 快速检测。 2夫 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T4789.7食品卫生微生物检验副溶血性弧菌检验 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检验 SN/T1022出口食品中霍乱弧菌检验方法 NMKLNo.156食品中致病性弧菌的检测和计数 行业标准信息服务平台 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 3. 1 PCRpolymerase chain reaction 聚合酶链式反应。 3.2 MPCRmultiplexPCR 多重 PCR。 3. 3 DHPLCdenaturing high performance liquid chromatography 变性高效液相色谱。 3. 4 TEAA 三乙基铵乙酸盐。 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置。应按 1 SN/T 2564—2010 照GB19489的有关规定执行。 5废弃物处理和防止污染的措施 5.1检测过程中的废弃物需经121℃高压灭菌处理至少30min后再弃置。 5.2检测过程中防止交叉污染的措施按GB/T27403规定执行。 6原理 多重PCR，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上两对以上引物，同时 扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。DHPLC分析 （TEAA），核苷酸片段分子中带负电荷的磷酸根基团与TEAA分子中带正电荷的氨基发生静电作用相 互吸引，同时TEAA分子中的三个乙基与固定相Ci18表面的烷基发生疏水作用力而相互吸引,通过流动 相中的乙的梯度洗脱达到将不同大小的核苷酸片段分离。 7试剂和材料 除另有规定外，所有试剂纯度应为色谱纯。水为灭菌超纯水，符合GB/T6682中一级水的规格 所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。 7. 1 Taq DNA 聚合酶。 7.2dNTP:dATP,dTTP,dCTP,dGTP。 7.310XPCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4），200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。 7.4引物：引物序列见附录A表A,1。 业标准信息服务平 7.5TE溶液。 7.6 10% SDS。 7.7 蛋白酶K（20mg/mL）。 7.8 氯化钠溶液（NaCl):5mol/L和0.7mol/ 7.9 10% CTAB。 7. 10 三氯甲烷。 7. 11 异戊醇。 7.12酚。 7. 13 异丙醇。 7. 147 70%乙醇。 7.15DHPLC缓冲液：缓冲溶液A为50mLTEAA和250uL乙混合，加水定容至1000mL：缓冲 溶液B为50mLTEAA和250mL乙睛混合，加水定容至1000mL；缓冲溶液D为75%乙睛。 8 主要仪器和设备 8.1 PCR仪。 8.2 DHPLC 仪。 8.3高速离心机：离心转速18000g。 8.4PCR超净工作台。 2