ICS11.120.20 YY C 30 中华人民共和国医药行业标准 YY/T1465.5—2016 医疗器械免疫原性评价方法 第5部分：用M86抗体测定动物源性 医疗器械中 α-Gal抗原清除率 Immunogenic evaluation method of medical devices- Part 5 : Determination of a-Gal antigen clearance in medical devices utilizing animal tissucs and their derivatives with M86 antibody 2017-06-01实施 2016-07-29发布 国家食品药品监督管理总局 发布 YY/T1465.5—2016 前言 YY/1465《医疗器械免疫原性评价方法》，分为以下部分： 一·-第1部分：体外T淋巴细胞转化试验； 第2部分：血清免疫球蛋广和补休成分测定 ELISA法； 一·一第3部分：空断形成细跑测定琼脂固法； 第+部分：小鼠腹腔上噬细胞吞曦鸡红细胞试验 半休内法； 第5部分：用M86抗体测定动物源性医疗器械α-Gal抗原清除率。 本部分为YY/-1465的第5部分 本部分按照GB/1.1一2009给山的规则起罩 请注意本文的些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承扒识别这些专利的贡任。 本部分由国家食品药品监督管理总局提山， 本部分山企国医疗器械生物学评价标准化技术委员会（SAC/C218)归II。 本部分起节单位：山东省医疗器械产品质量检验中心、四川医疗器械物材料和制品检验中心、不 事医学科学院野战输血研究所、烟台止海生物技术有限公司。 本部分起节人：孙晓、刘成虎、表、杨晓琴、高红伟、锋、陆美娇、张东刚。 1 YY/T1465.5—2016 引言 受含有一定革α（Gal抗原的动物源性医疗器械材料时可能发生超急性免疫排压反应及慢性免疫再性 反应，NI86抗体是可以与大然或合成的糖蛋广和糖脂巾α-Gal抗原结合的特异性单克隆抗体。基丁 M86抗体的特异性，可以对动物源性医疗器械/材料中Gal抗原进行评价。 本部分使川M86抗休.通过比较处理前后待测样品中α-Gal抗原含量，计算α-Gal抗原的清除率， 为动物源性医疗器械中α-Gal抗原清除过程的有效性提供评价方法。本标准的方法受试验样品处理 过程中αGal抗原活性、M86抗体效价稳定性等内素影响。试验者宜根据试验样品的特性对方法的适 用性进行确认， YY/T1465.5—2016 医疗器械免疫原性评价方法 第5部分：用M86抗体测定动物源性 医疗器械中α-Gal抗原清除率 1范围 YY/1465的本部分给山了测定动物源性医疗器械α-Gal抗原清除率的方法，适用丁α-Gal抗 原清除过程有效性的评价。 本部分的方法适用于能通过研磨充分暴露αGal抗原的材料，如不能通过研磨充分尽露αGal抗 原，可考虑采用其他经确认的适亢方法 注：附录^给山了免疫纠织化学法评价方法的示例 2规范性引用文件 2 下列文件对于本义件的应用是必不可少的。凡是注Ⅱ期的引用义件，仅注Ⅱ期的版本适用于本义 件。凡足不注口期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）还用于本文件。 GB/16886.2医疗器械牛物学评价第2部分：动物福利要求（GB/T16886.2—2011， ISO109932:2006,IDT) GB/16886.20医疗器械生物学评价第20部分：医疗器械免疫萨现学试验原则与方法 (GB/T16886.20—2015.ISO/TS1099320:2006,IDT) 2007.IDT) 中国约典 2010版 3术语和定义 GB/二16886.20利YY/=0771.1界定的术语和定义适用于本文件。 4 试验原理 将试验样品和过量特异性M86抗体共同孵育，分离剩余的M86抗体并将其亏预先包被在固和载 体上的过量α-Gal抗原结合，加底物显色。将最终显色结果与木经去α-Gal抗原处理的样品测定结果相 比，即可得到试验样品中αGal抗原的清除率。 5试剂和仪器 5.1试剂 5.1.1 磷酸盐缓冲液（PBS），pH7.2～7.1 5.1.21以牛血清白蛋白（BSA)济液：0.1gBSA溶丁10ml.PBS溶液巾。 T YY/T1465.5—2016 5.1.3 包被液（碳酸盐绶冲液·pH9.6） 5.1.4市售小鼠M86抗体 5.1.5 抗小鼠标记二抗。 5.1.6 市售αGalBSA 5.2 仪器和设备 5.2.1 酶标仪。 5.2.2 低温离心机。 5.2.3 炭荡器 5.2.4 高精度天平（0.0001g） 6 试验步骤 6.1 试验样品处理 样品处理方法宜确保α-Gal抗原充分暴露、同时避免其被过度破坏，推荐经处理后的样品粒径分 布范围为（0um～90m）。附录B中给山了不同炎型样品处理的实例。 注1：动物源性生物材料以胶原纤维等结构蛋门为主要组成成分，试验者宜采用适宫的样品制备方法以确保试验 样品中的αGal抗原充分暴露。 注2：每份样品设平行样3份，最终测定结果吸其平均值， 定性 6.2 2试验系统对照品制备 6.2.1总则 考虑到本标准中的方法受多种因素的影响，试验前宜采用适的对照品对试验体系的合理性进行 验证，推荐使用小鼠骨髓瘤（SP2/0)细胞或免红细胞（RRBC）。如选用其他对照品，宜对其有效性迹行 确认。 6.2.2SP2/0细胞 SP2/0（ATCCCRL-1581TM）是由绵羊红细胞免疫的BAIB/c小鼠的脚脏B细胞和小鼠骨髓瘤 细胞融合得到，不分泌免疫球蛋I1，用RPMI1610完全培差基培养至生长状态良好.调整细胞浓度至 1人10"个/mL备用。 6.2.3RRBC 6.2.3.1推荐使川未进行过试验的健康新西家兔，SPF级。如选川H他品系家兔·对H适宝性进行 说明。取而前应将动物至少饲养5d以适应实验室环境。所有的动物试验应在纶国家认可机构批准并 符合实验率动物福利全部适川法规的实验率内进行，并H还应符合GB/T16886.2的要求， 6.2.3.2取新鲜家兔全血20ml，加人含玻璃珠的锥形瓶小振摇10min，除去纤维蛋。加人0.9%氯 化钠溶液约10倍量，播匀.2000rmin离心5min，除去上清液.沉淀的红细胞再用0.9氛化钠溶液按 上述方法洗涤3次，至上清液不显红色为止，将所得纠圳胞用0.9"。氯化钠溶液配成1人10°个/mI.， 1℃保存备用。 2 YY/T1465.5—2016 6.2.4制备步骤 用40μL，11,BSA年总1×10°个SP2/0细胞或RRBC，混匀后取20l.细胞倍比稀释，共4个浓度 梯度（包拆不含纠胞的空白）。分别向纠胞原液及稀释液中加人1"。13SΛ溶液，80L/管，则最高浓 度组含细胞原液的体积比为20义，随若倍比稀释其余各组体积比圣梯度降低。个浓度梯度3复孔 备用。 6.3试验分组 试验分组包括： a) 木经α-(Gal抗原去除过程的材料纠； b）经α-Gal抗原么除过程的材料； 阴性对照组，不含αGal抗原的材料； () d）试验剂对照组。 6.4最佳M86抗体稀释度的测定 6.4.1总则 不同批次M86抗体的效价可能有-·定的差，宜确定批次M86抗体的最佳稀释度。将购买的 市售M86等分成适宜休积，则存备币。 6.4.2at-Gal抗原标准品制备 取α-Gal-BS^济丁pH9.6的包被液，川人微孔板，100μL孔，推荐的终浓度为1μg/mL～ 10μgmL，4℃条件下包被过夜，用1入BSA时闭后备用。 6.4.3M86抗体最佳稀释度 在每个微孔板中分别加人100L倍比稀释的M86抗休溶液，共8个稀释度.推荐初始稀释度为 1：25，稀释度在1：25与1：3200之间。混勾.空温振荡孵育1.5h，用洗液洗板3次。加人HRP标 记的抗小鼠一抗，37（振荡孵育1h后，用洗液洗板3次。显色后：用酶标仪读圾吸光度值，绘前吸光度 值对成N86稀释度的反应线。取反应仙线刚进入平台区稀释度的两倍浓度值作为最租稀释度。 付次使用前将贮存的M86抗体重新稀释 6.5M86抗体共孵育 M86抗休溶液，即每个反应管的总体积为200l，混匀.4℃震荡孵育过夜.离心管在10000g离心 5min后报上清液备用。 6.6间接抑制ELISA法检测上清溶液中剩余M86抗体 在96孔板的相应孔中加入过串的α-Gal抗原溶液，100L/孔，4（孵育过夜洗液洗板3次，分 别取按6.5制各的100uL上清液加入应抗原包被的96孔板，37C振荡孵育2h后，用洗液洗板 3次。加入IIRP标记的抗小鼠抗，37（振荡孵育1h后.用洗液洗板3次。显色后、用酶标仪读取吸 光度俏。 3