ICS 11.040.01 YY C 30 中华人民共和国医药行业标准 YY/T1465.4—2017 医疗器械免疫原性评价方法 第4部分：小鼠腹腔巨噬细胞吞噬 鸡红细胞试验 半体内法 Immunogenic evaluation method of medical devices- Part 4 : Phagocytosis of mouse peritoneal macrophages on chicken erythrocytes- Ex-vivo method 2017-03-28发布 2018-04-01实施 国家食品药品监督管理总局 发布 YY/T 1465.4—2017 前言 YY/1165《医疗器械免疫原性评价方法》，分为以下部分： 一·-第1部分：体外T淋巴细胞转化试验； 第2部分：血清免疫球蛋广和补休成分测定（ELISA法）； 一·-第3部分：空斑形成细胞测定琼脂固相法； 第+部分：小鼠腹腔上噬细胞吞曦鸡红细胞试验 半休内法； 第5部分：用M86抗体测定动物源性医疗器械α-Gal抗原清除率。 本部分为YY/-1465的第4部分 有关其他方而的医疗器械免疫原性评价方法将有其他部分的标准。 本部分按照GB/1.1一2009给出的规则起节。 请江意本文仆的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担认别这些专利的责任。 本部分山国家食品药品监督管理总局提出。 本部分起草单位：四川医疗器械生物材料和制品检验中心、山东省医疗器械产品质量检验中心。 本部分起节人：表、梁洁、乔乔霞、郑秀娥。 1 YY/T1465.4—2017 引言 免疫应答是机体的-种亚要的防御机制。医疗器械作为外源性物质，在与人体接触后，可通过多利 途径影响机体的免疫系统。日前，还不清楚医疗器械或材料刺激产生的免疫应答对宿主有利还是有害， 提物进行免疫应容研究来获取科关的信息是非常带重要的。 医疗器械导致的免疫毒性反应可能涉及免疫应答的各个方血，他括刺激/急性炎症、慢性炎症、免疫 抑制、免疫刺激、超敏反应及门身免疫等。这些过程可能涉及多种免疫细胞.尤其是淋凹细胞，粒细胞及 曦细胞等。其中」噬细胞是一类要的免疫细胞，接参与固有性免疫和适应性免疫应答的多个力 而。GBT16886.20给山了与人体接触医疗器械可能发牛的免疫反应和潜在免疫毒性反成的指南， 但缺少具体的试验方法。YY/～1165的本部分预期为GB/T16886.20的实施提供具体的试验方法。 本部分给山的小鼠片噬细胞吞噬鸡红细胞能力测定方法，为医疗器械/材料对机体非特异性免疫及抗原 递里过程的影响提供检测方法，可作为GB/16886.20中免疫年现学试验中的项可供选择的方法标 准。仙该方法只有一定的局限性，在使而前，宜对方法的适用性逃行确认，其他经确认的方法也可以 采用。 YY/T1465.4—2017 医疗器械免疫原性评价方法 第4部分：小鼠腹腔巨噬细胞吞噬 鸡红细胞试验半体内法 1范围 YY/"1465的本部分给出了半体内法测定小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的方法。 本部分适用丁评价医疗器械/材料对片细胞谷瞬能力的影响。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的成用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仪注日期的版本适用丁木文 仆。凡是不注期的文件，其最新版木（包括所有的修改单）适用于本文件， GB/二16886.1医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验（GB/16886.1- 2011,ISO 10993-1:2009,IDT) GB/二16886.2医疗器械生物学评价 第2部分：动物福利要求（GB/T16886.2一2011， IS010993-2:2006.IDT GB/16886.11医疗器械4物学评价多 第11部分：全身毒性试验（GB/16886.112011， ISO109936:2006.IDT) GB/16886.12 医疗器械牛物学评价3 第12部分：样品制备j参照品（GBT16886.12一 2005.ISO10993-12:2002,IDT) GB/16886.20 医疗器械生物学评价 第20部分：医疗器械免疫毒理学试验原则方法 (GB/T16886.20—2015.ISO/TS10993-20:2006.IDT) 3术语和定义 GB/16886.1、GB/T16886.2、GB/T16886.12和GB/T16886.20界定的术语和定义适于本 文件。 4试验原理 使用鸡红细胞免疫小鼠后，小鼠」噬细胞可将其作为异物识别并吞噬。过染色计数吞噬了鸡红 细胞的山噬细胞的数量可反映噬细胞的吞噬功能。当医疗器械材料作用于机体时，通过检测山噬细 胞对鸡红细胞的吞瞬能力的变化情况，即评价医疗器械/材料对机休上曦细胞吞赚功能的影响。 5试验动物 5.1 动物种属的选择 本试验选择的动物种属为小鼠，雌雄不限，alb/c小鼠是优先推荐的品系。它使川体重在:18g～22g T YY/T 1465.4—2017 成年未生育过几未受孕的小鼠，在试验开始时，动物体差异宜最小，并不超过平均体亚的土20。当 有充分数据证实时，也可以选择其他品系动物。 5.2动物准备 所有的动物试验应在经国家认可机构批准并符合实验室动物福利个部适用法规的实验室内进行， 并且还应符合GB/T16886.2的要求，随机选择动物，进行个休标记.并丁试验前征实验室条件下适应 至少5d， 6样品制备及接触途径 6.1对丁医疗器械中常见的不溶性非降解物质，可根据GB/～16886.12的原则，制备样品浸提液。宜 使用适亢的溶剂进行川严没提，以溶山所可没提的分，没提液亢当日制备除非有稳定性数据说明 贮存的可接受性。按照样品的预期用途，宜按照GB/=16886.11的要求确定样品/没提液的动物接触 方式。常川的动物接触方式可位括灌出，腹腔注射及静脉注射等。接触剂量及接触时问可参考 GB/T16886.11中急性.业急性，业慢性及慢性全身声性试验的要求进行设计.并在最终试验报告中 写明。 6.2对于可降解的医疗器械，应根据预期临床应用方式设计器械与动物接触/免疫方式。当有可获得 的研究文献时，可以考虑采用已有文献报道的方法进行试验设计，以与现有数据进行比较，当没有可参 考的动物接触/免疫方式时，可考虑与预期临床应用方式相似的植入途径， 6.3液体试验物质可直接用或稀释使用 注：医疗器械中免疫原多为人分了物质，如制备样品授提液，立对选用提方法的有效性进行说明。 7对照样品的选择 7.1阳性对照 推荐使用能够促进巨噬细胞吞噬能力的阳性对照物质包括：100IU/g的·I扰素（IFN)或 10mg/kg植物血凝素A(PI1A)；能够抑制片曦细胞吞噬能力的阳性对照物质包括：5mg/kg的地寒米 松或20mg/kg的环磷既胺，也可使用其他经过充分论证的阳性对照试验物质。阳性对照物质的选 择及应用方式宜根据受试样品的预期用途及试验日的确定。 7.2阴性对照 注：当存在已知的有长期临床使用史，其免疫寿性水平已被认为可接受几与试验样品组成与预期使用方式均相同 的已上市产品时，也可作为阴性对照，但其应用需经充分的论证。 8试验步骤 8.1试验分组 将实验动物按照随机原则进行以下分织，每织至少5只动物： a）试验样品组； 阳性对照组； b)[ c）阿性对照织。 注：对材料或其没提液行梯度稀释有助丁得山免疫应答的剂品-效应关系，推荐试验样品组采川不同剂品逃行 试验. 2 YY/T1465.4—2017 8.2鸡红细胞悬液制备 新鲜抗凝鸡血，1000g离心5min后弃上清，川尤菌牛理盐水离心洗涤3次，弃去上清，用牛理 水将其配制成5%（体积分数）的鸡红纠胞忍液， 8.3样品及对照接触 样品接触阶段：各实验组动物按本标准第6竞选定的剂量，途径及周期迹行样品接触。阴性对照组 动物则接相同的方式以阴性对照品（浸提介质）进行接触： 1赚细胞春曦检测试验阶段：样品接触期结束后第1人及第2人各阳性对照组分别按以工设总 剂量的1/4分别注射性对照物质，试验组及附性对照组不逊行仆何操作。试验开始第3人各组各只 动物腹腔注射0.5%淀粉!理盐水溶液0.5ml，并丁注射后轻揉小鼠腹部以使其分散均匀，试验开始 第4大及第7大各阳性对照组分别按以上设定剂量的1/+再次分别注射阳性对照物质，试验样品组及 阴性对照纠不进行任何操作。 8.4鸡红细胞免疫 试验第8火每八动物腹腔注射5%的鸡红细胞悬液0.5mL8h12h后，处死动物.正中剪川腹 降皮肤，腹腔中注入2nl生理盐水，轻操小鼠腹部1min，吸出腹腔洗液1mL，分别滴于2张载玻片 上放入垫有湿纱布的只盖试验盒中，移至37℃孵箱中温育30min。温育完成，于：理盐水中漂洗，以 除去木贴壁的细胞，晾干后以1：1丙酮-醇溶液周定5min，+%（休积分数)Gicmsa-磷酸盐缓冲液染 液染色3min.流水冲洗，蒸馏水漂洗原干。 6 结果计算 魔指数， 吞噬鸡红细胞的噬细胞数 吞噬白分率－ 0.001 .(1) 效的片噬细胞总数 被吞噬的鸡红细胞总数 吞噬指数： ...(2) 计数的噬细胞总数 注1：若滴片额色过深，Ⅲ用1%HCI脱色；过浅则叫复染 注2：若腹降吸出液体为血性渗出液，不穴使币： 10结果判定 当试验组阴性对照组在吞曦分率与吞赚指数上山现有统计学意义的差异时，可认为试验物 质对小鼠上噬细胞吞曦功能有影响。如使川梯度稀释的材料物质或其浸提液逃行试验，山现吞嗪白分 率与谷噬指数上的剂尽效应关系时，提示可能存在对巨曦纠胞谷噬功能的影响， 11可靠性检查 11.1阳性对照是通过使用已证明对巨赚纠胞谷除功能且有促进或抑制作用的物质，求证实试验的适