ICS 11.040.01 YY C 30 中华人民共和国医药行业标准 YY/T1465.3—2016 医疗器械免疫原性评价方法 第3部分： 琼脂固相法 空斑形成细胞测定 Immunogenic evaluation method of medical devicesPart 3:Plaque forming cells assayAgar gel solid-phase method 2016-07-29发布 2017-06-01实施 国家食品药品监督管理总局 发布 YY/T1465.3—2016 前言 YY/T1465《医疗器械免疫原性评价方法》，分为以下部分： 第1部分：体外T淋巴细胞转化试验； 第2部分：血清免疫球蛋白和补体成分测定ELISA法； 第3部分：空斑形成细胞测定琼脂固相法； 第4部分：小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验 半体内法； -第5部分：用M86单克隆抗体测定动物源性医疗器械中α-Gal抗原清除率。 本部分为YY/T1465的第3部分 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家食品药品监督管理总局提出 本部分由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会（SAC/TC248)归口。 本部分起草单位：四川医疗器械生物材料和制品检验中心、山东省医疗器械产品质量检验中心。 本部分起草人：袁瞰、梁洁、盖潇潇、林振华 I YY/T1465.3—2016 引言 免疫应答是机体的一种重要的防御机制。医疗器械作为外源性物质，在与人体接触后，可通过多种 途径影响机体的免疫系统。目前，还不清楚医疗器械或材料刺激产生的免疫应答对宿主有利还是有害， 特别是针对动物源性医疗器械、同种异体器械和组织工程器械等。因此，应用医疗器械/材料组分或浸 提物进行免疫应答研究来获取相关的信息是非常重要的 医疗器械导致的免疫毒性反应可能涉及免疫应答的各个方面，包括刺激/急性炎症、慢性炎症、免疫 抑制、免疫刺激、超敏反应及自身免疫等。这些过程涉及多种免疫应答，包括非特异性免疫与特异性免 疫，体液免疫与细胞免疫等。其中，体液免疫指B细胞在T细胞的辅助下，接受抗原刺激后形成效应B 细胞和记忆细胞。效应B细胞（浆细胞)产生抗体与相应抗原特异性结合，产生免疫反应。体液免疫功 能变化的检测包括免疫球蛋白的定量检测，B细胞数量及功能的检测等。其中，特异性抗体形成细胞 （空斑形成细胞）的检测，因其简便，稳定，实验结果易于重复，尤其适用于免疫原对机体免疫应答的影响 而被广泛应用于评价药物、化学物质等对免疫系统的作用 GB/T16886.20中给出了与人体接触医疗器械可能发生的免疫反应和潜在免疫毒性反应的指南， 但缺少具体的试验方法。YY/T1465的本部分预期为GB/T16886.20的实施提供具体的试验方法。 YY/T1465的本部分给出的空斑形成细胞测定方法，为医疗器械/材料对机体体液免疫的影响提供检 测方法，可作为GB/T16886.20中免疫毒理学试验中的一项可供选择的方法标准。但该方法具有一定 的局限性，在使用前，宜对方法的适用性进行确认。其他经确认的方法也可以采用。有关其他方面的医 疗器械免疫原性评价方法将有其他部分的标准。 YY/T1465.3—2016 医疗器械免疫原性评价方法第3部分： 空斑形成细胞测定琼脂固相法 1范围 YY/T1465的本部分给出了琼脂固相法测定空斑形成细胞的方法。 本部分适用于评价医疗器械/材料对机体体液免疫功能的影响。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验（GB/T16886.1- 2011,ISO10993-1:2009,IDT) GB/T16886.2 医疗器械生物学评价 第2部分：动物福利要求（GB/T16886.2一2011， ISO10993-2:2006,IDT) GB/T16886.11医疗器械生物学评价 第11部分：全身毒性试验（GB/T16886.11一2011， ISO10993-6:2006,IDT) GB/T16886.12 2医疗器械生物学评价 第12部分：样品制备与参照样品（GB/T16886.12- 2005,ISO10993-12:2002,IDT) GB/T16886.20医疗器械生物学评价 第20部分：医疗器械免疫毒理学试验原则和方法 (GB/T16886.20—2015,ISO/TS10993-20:2006,IDT) 3术语和定义 GB/T16886.1、GB/T16886.2、GB/T16886.12和GB/T16886.20界定的术语和定义适用于本 文件。 4试验原理 使用绵羊血红细胞（SRBC)致敏小鼠后，小鼠的免疫器官，尤其是脾脏中会出现能够产生抗SRBC 抗体的B淋巴细胞（浆细胞）。这些细胞的数量与功能能够反映机体体液免疫功能的状况。当将这些 能分泌抗SRBC抗体的细胞与SRBC一起孵育时，释放出的抗体将结合于SRBC上形成抗原抗体复合 物，在补体的参与下，导致这些B淋巴细胞周围的SRBC发生溶解，出现空斑情况。当医疗器械/材料 作用于人体时，通过检测这些空斑形成细胞数量的变化情况，即可评价医疗器械/材料对机体体液免疫 功能的影响。 1 YY/T1465.3—2016 5试验动物 5.1 动物种属的选择 本试验选择的动物种属为小鼠，雌雄不限。BalD/c小鼠是优先推荐的品系。宜使用体重在18g~ 22g成年未生育过且未受孕的小鼠。在试验开始时，动物体重差异宜最小，且不超过平均体重的 ±20%。 5.2动物的准备 所有的动物试验应在经国家认可机构批准并符合实验室动物福利全部适用法规的实验室内进行， 并且应符合GB/T16886.2的要求。随机选择实验动物，进行个体标记，并于试验前在实验室条件下适 应至少5d。 6样品制备及接触途径 6.1 对于医疗器械中常见的不溶性非降解物质，可根据GB/T16886.12的原则，制备样品浸提液。应 使用适宜的溶剂进行加严浸提，以溶出所有可浸提的组分。浸提液宜当日制备除非有稳定性数据说明 贮存的可接受性。按照样品的预期用途，参考GB/T16886.11的要求确定样品/浸提液的动物接触方 式。常用的动物接触方式可包括灌胃，腹腔注射及静脉注射等。接触剂量及接触时间可参考 GB/T16886.11中急性，亚急性，亚慢性及慢性全身毒性试验的要求进行设计，并在最终试验报告中 写明。 6.2对于可降解的医疗器械，应根据预期临床应用方式设计器械与动物接触方式，包括灌胃，腹腔注射 及静脉注射等。当有可获得的研究文献时，可以考虑采用已有文献报道的方法进行试验设计。当没有 可参考的动物接触方式时，可考虑与预期临床应用方式相似的植人途径。 6.3液体试验物质可直接使用或稀释使用。 注：医疗器械中免疫原多为大分子物质，如制备样品浸提液，宜对选用浸提方法的有效性进行说明。 7对照样品的选择 7.1[ 阳性对照 推荐的阳性对照试验物质是：200mg/kg环磷酰胺或5mg/kg地塞米松。也可使用其他经过充分 论证的阳性对照试验物质。 7.2 阴性对照 使用GB/T16886.12中推荐的浸提介质（如生理盐水），以与试验样品相同的处理方式进行操作。 注：具有长期临床使用史，其免疫毒性水平已被认为可接受且与试验样品组成与预期使用方式均相同的已上市产 品，也可作为阴性对照，但其应用需经充分的论证。 7.3 3空白对照 未经任何处理的同批实验动物。 2 YY/T1465.3—2016 8试验步骤 8.1试验分组 按随机原则进行以下分组，每组至少5只动物： 试验样品组； a)j b) 阳性对照组； c) 阴性对照组； d）空白对照组。 注：对材料或其浸提液进行梯度稀释有助于得出免疫应答的剂量-效应关系，推荐试验样品组采用不同剂量进行 试验。 8.2 样品及对照接触 各实验组动物按选定的剂量，途径及周期进行样品接触。阴性对照组动物则以相同的方式与阴性 对照品（浸提介质）进行接触。 8.3SRBC免疫 0.2mL/只。同时，阳性对照组动物进行腹腔注射。SRBC注射后第4天处死动物进行试验。 8.4脾细胞悬液制备 经SRBC免疫后的小鼠，处死后立即剖取脾脏置冰浴中，加少许Hank’s液，以20O目尼龙筛网制 备脾细胞悬液。用无血清培养基或Hank's液将所获得的脾细胞悬液配制成5×106个/mL，用0.5% 台盼蓝染色观察活细胞数应在90%以上。 8.5 琼脂糖制备 配制1%的琼脂糖，与等量的2倍浓度Hank's液混合，121℃高压灭菌30min后，分装于45℃～ 50℃水浴保温的小试管中，每试管2mL。 8.6混合及空斑形成细胞计数 106个/mL），迅速混匀后倒人直径35mm的塑料平皿内，每只动物做3个平行样，待凝固后，将平皿放 人37℃，5%CO培养箱孵育1.5h，然后以SA缓冲液稀释的补体（1：8～1：15)加人到平皿表面，继 续孵育1.5h，计数溶血空斑数 注：如需保存结果，可在平皿内加人用生理盐水或PBS配制的0.25%戊二醛6mL固定。 9结果计算 9.1以每10°个脾细胞所含的空斑形成细胞数表示结果。 9.2每只动物至少应制备3个琼脂平血，应报告每只动物的空斑形成细胞均值及标准差，并选取适当 的统计学方法进行各组之间的比较。 YY/T1465.3—2016 10 结果判定 当试验组与