YY C30 中华人民共和国医药行业标准 YY/T0879.1—2013 医疗器械致敏反应试验 第1部分：小鼠局部淋巴结试验（LLNA） 放射性同位素掺入法 Testfor sensitization of medical devices- Part 1:Murine local lymph node assay (LLNA) :Radioisotope incorporationmethod 2013-10-21发布 2014-10-01实施 国家食品药品监督管理总局 发布 YY/T0879.1—2013 前言 YY/T0879的总标题是《医疗器械致敏反应试验》，包括以下部分： 第1部分：小鼠局部淋巴结试验（LLNA）放射性同位素掺人法； 有关其他方面的致敏反应试验将有其他部分的标准。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 YY/T0879的本部分参考ASTMF2148-2007《使用小鼠局部淋巴结试验（LLNA）评价迟发型接 触性超敏反应的标准规范》制定。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家食品药品监督管理总局提出。 本部分由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会（SAC/TC248)归口。 本部分主要起草单位：国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心。 本部分参加起草单位：国家食品药品监督管理局北大医疗器械质量监督检验中心、上海生物材料研 究测试中心。 本部分主要起草人：孙立魁、侯丽、刘成虎、韩建民、孙皎、陆华。 1 YY/T0879.1—2013 引言 医疗器械的材料组分、加工助剂或清洗及灭菌残留物都可能诱发机体发生超敏反应。 GB/T16886.10中推荐了三种测定医疗器械潜在皮肤致敏性的动物试验，包括豚鼠最大剂量试验 （GPMT）、封闭式贴敷试验（Buehler试验）和小鼠局部淋巴结试验（LLNA）。GB/T16886.10未给出 LLNA方法步骤。 目前国际间已接受LLNA为豚鼠试验的唯一替代试验用于检验单一化学物，为化学物的首选测定 法。与豚鼠致敏试验相比，LLNA具有以下优点： a) 试验周期短。LLNA总周期为7天，而豚鼠致敏试验则需要24天。 b） 所需试验动物较小。相比之下，LLNA更符合GB/T16886.2中动物福利要求。 c） LLNA能得到刺激的定量反应数据，而非主观评价，可用于剂量效应的测定，并提供可进行统 计学分析的客观数据。 与豚鼠致敏反应相似，LLNA也是首选用于单一化学物致敏潜能的检测。LLNA检测了初期（诱 导）的致敏过程，而豚鼠致敏试验则检测了后期（激发）的致敏过程。对不能渗透皮肤的某些金属和高分 子量试验样品出现假阴性、假阳性的情况，可能需要豚鼠试验来评价其潜在的致敏性。YY/T0879的 本部分中需要使用放射性同位素。因此，鼓励寻找放射性同位素的替代品，当新方法得到确认后， YY/T0879的本部分即可采用。 I YY/T0879.1—2013 医疗器械致敏反应试验 第1部分：小鼠局部淋巴结试验（LLNA） 放射性同位素掺入法 1范围 YY/T0879的本部分给出了医疗器械/材料致敏试验的检测方法。 本部分预期为豚鼠致敏试验提供一个替代性方法，尤其适用于只接触完好皮肤的医疗器械/材料。 然而，当评定金属材料或用于深部组织或损伤表面医疗器械产品/材料的致敏反应时，仍然推荐使用豚 鼠致敏试验。 本部分只适用于能浸入皮肤的低分子量化学物，该吸收的化学物或代谢物可结合于大分子物质，如 蛋白质以形成免疫原性复合物。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T16886.1 医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验 GB/T16886.2 医疗器械生物学评价 第2部分：动物福利要求 GB/T16886.10 医疗器械生物学评价 个第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验 GB/T16886.11 医疗器械生物学评价 第11部分：全身毒性试验 GB/T16886.12 医疗器械生物学评价 第12部分：样品制备与参照样品 3术语和定义 GB/T16886.1、GB/T16886.2和GB/T16886.10界定的术语和定义适用于本文件。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AOO：丙酮橄榄油溶液（4：1体积比） DMSO：二甲基亚矾 DNCB:2，4二硝基氯苯 ICCVAM：机构间替代方法评价协调委员会 PBS：磷酸盐缓冲液（pH7.2） TCA：5%三氯乙酸 3H-TdR："H-胸腺啶核苷，7.4×101°Bq/mm（2Ci/mM）（PBS中）；I125IUDR-1125放射性尿嘧啶 核苷 1 YY/T0879.1—2013 5试验样品的制备 5.1宜根据GB/T16886.12推荐的原则制备试验样品。所有固体材料应进行浸提。应使用极性溶剂 （水性）和非极性（非水性或有机）溶剂，如DMSO或AOO等进行浸提。 5.2非刺激性液体试验样品和凝胶应直接使用。刺激性液体应根据液体试验样品的溶解度，使用极性 或非极性溶剂进行稀释，直到溶液没有刺激性。 5.3全水溶液不适用于耳部。因此，宜在每10mL极性对照和试验溶液中加入0.05g羟乙基纤维素 以辅助溶液在耳部存留。 5.4用于浸提的试验样品宜与器械最终使用的表面相一致。 5.5样品应按照终产品灭菌的方法进行灭菌。 5.6宜注意制样过程中不要污染样品，推荐使用无菌技术操作。 注：LLNA检验化学物一般采用剂量效应方式。医疗器械供试样品可能为浸提液，这种情况下仅有单剂量用于试 验，一般可检验未稀释的浸提波、不过，当浸提液含有高毒性成分时，毒性在LLNA中可导致阴性反应。因此 在LLNA中检验高毒性浸提液（见GB/T16886.5)时，推荐采用剂量效应方式和稀释浸提液。 6阳性对照的制备 称取0.025g的DNCB并放人烧瓶中。加人足量的DMSO完全容解DNCB， 6.1非极性阳性对照 加人DMSO补足10mL。盖住并摇晃烧瓶直到获得均勺的溶液 阳性对照的剂量以临床观察中不产 生全身毒性为宜。 6.2极性阳性对照 中性福尔马林可购买市售商品。 （或用PBS稀释甲醛，甲醛体积为总体积的 1/10。稀释方法：在10mL的烧瓶中放人1mL的甲醛。加人足量的PBS混合这两种溶液，另加PBS 盖住并摇晃烧瓶直到获得均匀的溶液。） 补足10mL， 6.3极性溶液不适用于耳部。 因此，本试验中，在每10mL极性阳性对照溶液中加人0.05g羟乙基纤 维素以辅助溶液在耳部存留直到吸收。 6.4对所有需要浸提的样品，按照GB/T16886.12制备极性和非极性浸提液（推荐使用DMSO或 AOO，但也可使用ICCVAM文件所列出的其他浸提介质）。 注：在经常进行LLNA时在6个月或更长时间内的阳性反应具有良好的一致性，宜至少每6个月进行一次阳性物 对照实验。 7动物处理 7.1动物选择与饲养 宜使用7～12周龄、健康、未孕的雌性CBA/Ca或CBA/j小鼠。体重差异应低于平均体重的20%。 其他适宜的实验动物品系如BALB/c也可使用，但宜进行论证。根据处理分组，每笼5只饲养。所有的 动物试验应在经国家认可机构批准并符合实验室动物福利全部适用法规的实验室内进行，并且还应符 合GB/T16886.2的要求。 7.2试验前动物准备 第1天，检查并标记每组动物（不能使用耳部标记法）。精确称量每只小鼠的体重。 7.3供试液处理动物 7.3.1阳性对照组、阴性对照组和试验样品组至少使用5只小鼠。受试动物每日双耳背部局部给予 2 YY/T0879.1—2013 25μL供试液，连续3天。对于只有极性供试液组，宜在处理前用丙酮擦拭耳背部皮肤，以帮助其吸收。 7.3.2试验中，除了液体试验物质，应包括：极性和非极性阳性对照，极性和非极性浸提介质对照，试验 样品的极性浸提液和试验样品的非极性浸提液。 7.3.3对于液体试验物质，应包括：极性和非极性阳性对照，液体试验样品，和适用于液体样品特性的 极性或非极性浸提介质对照。 7.3.4浸提液应在制备后24h内使用，并宜室温贮存。第2天和第3天分别处理，间隔24h士2h。 表1描述了每天的试验内容。 7.3.5 每日观察每只小鼠试验部位的局部刺激征象以及全身毒性征象（见GB/T16886.10和 GB/T16886.11）。如果怀疑器械/材料为刺激物，建议采用2只小鼠进行预试验。 表1LLNA操作时间表 天数 d <1 制备第1天使用的浸提液并准备第2天和第3天的浸提液 1 小鼠称重、标记并用试验样品处理耳部 观察小鼠并记录任何毒性或刺激体征，处理耳部 3 观察小鼠并记录任何毒性或刺激体征，处理耳部 观察小鼠并记录任何毒性或刺激体征 观察小鼠并记录任何毒性或刺激体征 第3天处理小鼠后72h 3h. 制备放射性同位素，观察小鼠的毒性或刺激体征称重并静脉注 射放射性同位素、注射后5h士54min，处死小鼠并制备淋巴结细胞，细胞沉淀18h 制备细胞 放射性计数 数据分析 注：以下步骤到8.32直到沉淀18h的步骤需要至少8h才能完成，实验室应具备这种条件。 7.4 放射性同位素示踪物的制备 7.4.1制备工作浓度的H-TdR2.96×10°Bq/mL（80μCi/mL）（体积分数），或用含10-5mol/L氟脱 用放射性物质的标准警示信息。实验室应有操作放射性物质的资质并且所有人员经过适宜的培训和取 得合格证书。 7.4.2将0.8mL的3.