YY 中华人民共和国医药行业标准 YY/T0870.1—2013 医疗器械遗传毒性试验 第1部分：细菌回复突变试验 Test for genotoxicity of medical devices- Part 1:Bacterial reverse mutation test 2013-10-21发布 2014-10-01实施 国家食品药品监督管理总局 发布 涂屋查真伪 YY/T0870.1—2013 前言 YY/T0870的总标题是《医疗器械遗传毒性试验》，包括以下部分： 第1部分：细菌回复突变试验； 第2部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验； 第3部分：用小鼠淋巴瘤细胞进行的体外哺乳动物细胞基因突变试验； 一第4部分：哺乳动物骨髓红细胞微核试验； 第5部分：哺乳动物骨髓染色体畸变试验。 有关其他方面的遗传毒性试验将有其他部分的标准。 本部分为YY/T0870的第1部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 YY/T0870的本部分是参考OECD471一1997《细菌回复突变试验》并结合医疗器械/材料自身特 点制定的。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家食品药品监督管理总局提出。 本部分由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会（SAC/TC248)归口。 本部分主要起草单位：国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心。 本部分参加起草单位：国家食品药品监督管理局天津医疗器械质量监督检验中心、国家食品药品监 督管理局北京医疗器械质量监督检验中心。 本部分主要起草人：曾冬明、黄经春、于兆琴、陶剑、汤菊莉。 I YY/T0870.12013 引言 GB/T16886.3中给出的检测潜在遗传毒性物质的试验方法均为经济合作与发展组织（OECD)《化 学品测试指南》中规定的方法，但这些方法是针对化学品的特性制定而成，同时未给出详细的试验步骤， 因此不适宜直接用于医疗器械/材料的检测。YY/T0870参照OECD试验方法基本原则，并根据医疗 器械/材料的特性对试验方法进行了适当的修改，规定了详细的试验步骤，可作为GB/T16886.3中遗 传毒性试验的补充方法标准。 YY/T0870的本部分参照OECDNo.471（1997)方法，有或无代谢活化系统的情况下，通过观察医 疗器械/材料诱导组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌株（his-）和色氨酸营养缺陷型大肠杆菌菌株的突 变情况，以评价其潜在的致突变性。 点突变是许多人类遗传性疾病的原因。有确切的证据表明，体细胞的癌基因和肿瘤抑制基因的点 突变与人类和实验动物的肿瘤形成有关。许多试验菌株因具有多种特性，如回复位点的DNA序列、细 胞对大分子通透性的增加、DNA修复系统的缺失或DNA修复过程中错配的提高等，而使得它们对突 变的检测更为敏感。其中，细菌回复突变试验具有快捷、廉价并且相对容易操作等优点，可用来检测 DNA碱基对的替代、增加或缺失，为遗传毒性物质诱导的突变类型提供有用的信息。 Ⅱ YY/T0870.1—2013 医疗器械遗传毒性试验 第1部分：细菌回复突变试验 1范围 YY/T0870的本部分规定了医疗器械/材料细菌回复突变试验方法。 本部分推荐使用平板掺人法。 注：口腔材料的Ames试验见YY/T0127.10。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验 GB/T16886.3医疗器械生物学评价第3部分：遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验 GB/T16886.12B 医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品 3术语和定义 GB/T16886.1、GB/T16886.3和GB/T16886.12界定的术语和定义适用于本文件。 4主要设备 生物安全柜、电热干燥箱、恒温培养箱、恒温水浴箱、恒温振荡水浴箱、压力蒸汽灭菌器、低温高速离 心机、低温冰箱（一80℃)或液氮罐、匀浆器、菌落计数仪和电子天平等。 5 活化系统、培养基和试剂 试验用活化系统（S9和S9混合液）、培养基和试剂按附录A和附录B的规定制备或购买市售产品。 6 菌株及其鉴定和保存 6.1菌株 本部分宜至少采用4株鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株进行试验，推荐的菌株组合为： a) 鼠伤寒沙门氏菌株TA1537或TA97或TA97a； b) 鼠伤寒沙门氏菌株TA98； c) 鼠伤寒沙门氏菌株TA100； 大肠杆菌WP2uvrA，或WP2uvrA（pKM101)，或鼠伤寒沙门氏菌株TA102； (P e) 鼠伤寒沙门氏菌株TA1535（可供选择）。 注：为了检测交联突变剂，所选菌株中最好包括TA102或增加一种DNA易修复的大肠杆菌株（如WP2或WP2 (pKM101)。 1 YY/T0870.1—2013 6.2菌株特性 菌株特性应与表1相符。突变型菌株的某些特性容易丢失或变异，在下列情况下，应进行菌株基因 型的鉴定并形成文件： a) 在收到培养菌株后； b) 当制备一套新的冷冻保存或冰冻干燥菌株时； c) 当每血自发回变数不在正常范围时； (P 当对诱变剂丧失敏感性时； e) 使用主平板传代时； f) 投入使用前。 表1 菌株鉴定结果 基因型 R因子 菌株 组氨酸 脂多糖 自发回变 uvr （抗氨青 抗四环素 屏障缺失。 修复缺陷 菌落数 陷 霉素)° TA97 90~180 TA98 十 TA100 + 120~200 TA102 + ~320 TA1535 + TA1537 + ~28 WP2(pKM101) 7~23 。“+”表示需要组氨酸。 b“+”表示有抑制带。 “+”表示具有 R因子 a“+”表示有四环素抗性。 。“+”表示无修复能力 该数值为参考值，可在验证的基础上确定本实验室的规定数值范围 菌株鉴定 6.3 6.3.1 增菌培养 在5mL营养肉汤培养基中接种贮存菌培养物，于（37土2）℃条件下振荡（115r/min～125r/min） 培养10h~12h。 6.3.2 组氨酸缺陷型的鉴定 6.3.2.1加热融化底层培养基两瓶（一瓶不加组氨酸，一瓶加组氨酸），不加组氨酸者每100mL底层 培养基中加0.5mmolD-生物素0.6mL;加组氨酸者每100mL底层培养基中加L-组氨酸1mL(每 100mL中含0.4043g）和0.5mmolD-生物素0.6mL，冷却至50℃左右，各倒两个平皿。 2 YY/T0870.1—2013 6.3.2.2接种：取有组氨酸和无组氨酸培养基平血各一个，按菌株号顺序各取一白金耳菌液划线（直 线）接种在培养基表面，37℃培养48h。 6.3.2.3结果判定：受试菌株在有组氨酸培养基平血表面各长出一条菌膜，无组氨酸培养基平血上除 自发回复突变菌落外无菌膜，说明受试菌株确为组氨酸缺陷型。 6.3.3脂多糖屏障缺陷的鉴定 6.3.3.1接种：取菌液0.1mL移人平血，迅速将加热融化的营养肉汤琼脂培养基（冷却至50℃左右） 适量倒人平血，混匀，平放凝固。将一片无菌滤纸片放入已凝固的培养基平皿中央，用移液器在滤纸片 上滴加0.1%结晶紫溶液10μL，37℃培养24h，每个菌株做一个平血。 6.3.3.2结果判定：阳性者在纸片周围出现一个透明的抑制带，说明存在rfa（深粗型）突变。TA97、 TA98、TA100、TA1535、TA1537、TA102和WP2（pKM101)均有抑制带，野生型鼠伤寒沙门氏菌和野 生型WP2（pKM101）没有抑制带。 6.3.4R因子的鉴定 6.3.4.1加热融化营养肉汤琼脂培养基，冷却至50℃左右，适量倒平血中，平放凝固，用移液器吸 0.8%氨苄青霉素10μL，在凝固的培养基表面依中线涂成一条带，待氨苄青霉素溶液干后，用接种环与 氨苄青霉素带相交叉划线接种要鉴定的菌株，并且接种一个不具有R因子的菌株作氨苄青霉素抗性的 对照（一个平皿可同时鉴定几个菌株），37℃培养24h。 6.3.4.2结果判定：菌株经过24h培养，在氨苄青霉素带的周围依然生长不受抑制，即有抗氨苄青霉 素效应，证明带有R因子。 6.3.5uvrB修复缺陷型的鉴定 6.3.5.1在营养肉汤琼脂培养基平皿表面用接种环划线接种需要的菌株。接种后的平皿一半用黑纸 覆盖，在距15W紫外线灭菌灯33cm处照射8s，37℃培养24h。 6.3.5.2结果判定：对紫外线敏感的菌株仅在没有照射过的部分生长。 6.3.6四环素抗性的鉴定 6.3.6.1用移液器各吸取5μL10μL0.8%的四环素溶液和0.8%的氨苄青霉素溶液，在营养肉汤 霉素带相交叉划线接种TA102和一种有R因子的菌株（作为四环素抗性的对照），37℃培养24h。 6.3.6.2结果判定：TA102菌株生长不受抑制，对照菌株有一段生长抑制区，表明TA102菌株有抗四 环素效应。 6.3.7自发回变菌落数的鉴定 保温。 6.3.7.2在每管顶层培养基中，分别加人待鉴定的试验菌株的菌液0.1mL，各2管，轻轻摇匀，迅速将 此试管的内容物倾入已固化的底层培养基平血中，转动平血，使顶层培养基均匀分布，平放固化，37℃ 培养48h计数菌落数，计算平均自发回变菌落数。 6.3.7.3结果判定：每一菌株的平均自发回变菌落数应落在表1所列正常范围内。 6.4菌株保存 鉴定合格的菌种应加人冷冻保护剂（例如光谱级二甲基亚砜（DMSO）或甘油），保存在深低温