ICS _11.100 SN A 80 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5159—2019 化学品 转基因啮齿类动物体细胞和 生殖细胞基因突变试验 Chemicals-Transgenic rodent somatic and germ cell gene mutation assays 2019-10-25 发布 2020-05-01实施 中华人民共和国海关总署‧发布 SN/T 5159—2019 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则编写。 本标准修改采用联合国经济合作发展组织（OECD)化学品试验导则No.488《转基因啮齿类动物体 细胞和生殖细胞基因突变试验》（2013.07）（英文版）。 本标准与OECD化学品试验导则No.488相比，存在以下差异： 对OECD化学品试验导则No.488按照GB/T1.1给出的规则进行了编辑性修改； 一删除了介绍部分； 一删除了实验前需考虑事项部分； 一删除了参考文献； 将附录部分内容改成术语、定义和缩略语部分。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国天津海关、中华人民共和国北京海关。 本标准主要起草人：王华、张捷、李晶、杨向莹、杨磊、翟自芹。 SN/T 5159—2019 化学品转基因啮齿类动物体细胞和 生殖细胞基因突变试验 1范围 数据和报告。 本标准适用于体内化学品致啮齿类动物基因突变性的评价。 2术语、定义和缩略语 下列术语、定义和缩略语适用于本标准。 2.1术语和定义 2.1.1 转基因Transgenic 有机体或其相关基因组被其他物种的一个或多个基因转入而发生改变。 2.1.2 基因突变 EGenemutation 基因组DNA在分子结构上发生的可遗传的变异，可发生于生殖细胞或体细胞 2.1.3 Mutation frequency 突变频率 突变体在群体总数中的比率。 2.2缩略语 2.2.1 TGR Transgenic rodent 转基因啮齿类动物 3试验方法 3.1原理 靶基因来源于细菌或噬菌体，将靶基因整合到入噬菌体或穿梭质粒载体，使啮齿类动物的基因组 DNA获取该基因。这个过程包括从啮齿类动物靶组织中提取基因组DNA，体外包装基因组DNA（如入 载体的包装，或通过捆绑和电穿孔质粒获取穿梭载体），随后在适当的条件下，检测细菌受体中突变的发 生。本试验采用从许多组织中容易重新获得的中性转基因。 TGR基因突变试验需要将受试物暴露于啮齿类动物一段时间，给药途径可以是任何合适的方式， 包括植人试验（如医疗器械试验）。动物染毒的整个时期被称为处理期。处理期与处死动物之间通常间 隔一段时间，这段时间内，动物不再给药，未修复DNA片段被固定于稳定的突变中。这个时期也可称 1 SN/T 5159—2019 为表现期、固定期或表达期等；这个时间结束后是采样期。在动物死亡后，从靶组织中分离并纯化基因 组DNA。 每只动物单一组织经多重包装和连接的数据通常在整合后评价突变频率，通常用105～10°之间的 空斑形成或克隆形成单位来评价。当使用阳性选择法时，用一套单独的非选择性平血来测定总的空斑 形成单位。 穿梭载体中cII基因的点突变和入red和gam基因中（Spi-选择性gtp小鼠和大鼠）的缺失突变。通 过用同一DNA样本中总空斑/质粒数除含突变的空斑/质粒数来计算突变率。在TGR基因突变研究 突变测序进行修正以适用于克隆扩增。 在lacI、lacZ、cII和gpt点突变试验中测得的突变主要包括单碱基置换突变、移码突变和小的插 入/缺失。这些突变类型在自发突变中的比例与在内源性Hprt基因中所见的相似。检测大的缺失只 能用Spi-筛选试验和lacZ质粒试验。目的突变是在小鼠和大鼠体内发生的突变。在噬菌体/质粒复 苏、复制或修复等过程中可能发生的体外突变相当少，并在一些体系中能够被明确的识别或被细菌宿 主/阳性选择系统排除。 3.2准备 3.2.1转基因动物模型的选择 可用于TGR基因突变试验的转基因动物有：整合有lacZ的噬菌体载体转基因小鼠，整合有lacZ 的质粒载体转基因小鼠；gpt delta(gpt和Spi-）转基因小鼠和大鼠，lacI转基因小鼠和大鼠。在TGR 大鼠中生长的肿瘤的致癌机制，或与大鼠毒性试验共同进行，或已知大鼠的代谢机制与人类更相近），应 考虑使用转基因大鼠模型。 3.2.2饲养条件 实验动物房温度应为22℃士3℃。相对湿度30%～70%。人为控制光照，12h明，12h暗。常规 实验室饲料，不限制饮水。当掺入饲料染毒时，应采取适当的方法以确保受试物与饲料适当混匀。同性 别的动物可以分组饲养（每组不超过5只），也可单独饲养。 3.2.3动物的准备 使用健康的刚成年动物（8～12周龄），对照组和给药组随机分组。动物应唯一标识。在实验室条 件下，动物驯化至少5d。饲养笼的安排应将饲养笼放置效应降至最小。在试验开始时，动物体重差异 应不超过各性别平均体重的士20%。 3.2.4剂量准备 固体受试物应溶解或悬浮在适当的溶剂或介质中，或混合在饲料或饮水中。液体受试物可以直接 体悬浮颗粒的形式给药。受试物应现用现配。 3.3试验条件 3.3.1溶剂或赋形剂 溶剂或赋形剂的量不应产生毒性效应，并确定不与受试物发生化学反应。如果用的不是已知溶剂 SN/T 5159—2019 或赋形剂，应该有参考数据支持其适用性。水应作为首选的溶剂或赋形剂。 3.3.2阳性对照 应同时使用阳性对照动物。对于已经证明有资格和常规采用本试验的实验室，可以在试验中使用 以前的阳性对照组动物DNA以证实该试验成立与否。这种来自于以前试验的DNA应该从相同的物 种和靶组织中获得，并且妥善储存。当同时进行阳性对照时，不必采取与受试物相同的暴露途径。阳性 对照应该是能够在受试物对应的一个或多个靶组织中诱导突变。阳性对照应该选择能产生较弱或中等 程度阳性结果的剂量，这样可以精确地评估试验的操作性和敏感性。表1中列出阳性对照物和它们的 靶组织。 表11 阳性对照物质及其靶组织 突变靶组织 化学品和CAS号 特性 大鼠 小鼠 骨髓、结肠、结肠上皮细胞、肠、 N-亚硝基-N-乙基脲759-73-9 直接诱变剂 肝脏,肺 肝、肺、脾、肾、卵巢颗粒组织、雄 性生殖细胞 诱变剂，需要代谢活化，但是 氨基甲酸乙酯51-79-6 骨髓、前胃、小肠、肝脏、肺、脾 仅产生弱的效果 诱变剂，需要代谢活化，在 肝脏 2,4-二氨基甲苯95-80-7 肝脏 Spi-试验中也是阳性 骨髓、乳房、结肠、前胃、胃腺、心 苯并（a)芘50-32-8 诱变剂，需要代谢活化 肝脏、网膜 脏、肝脏、肺和雄性生殖细胞 3.3.3阴性对照 仅用溶剂或溶媒单独处理，与给药组的处理方法相同，并在每个采样时间点均应设置。如果没有历 史的或公布的对照数据证实所用溶媒或溶剂的无害性或无诱变性，每个采样时间点均应该设有未处理 对照，以证明所用溶剂/溶媒的可接受性。 3.3.4实验室能力验证 通过证明能够重复已公布的资料的预期结果，以证明具有进行这些试验的能力。这些试验资料包 因恢复（如组装效率）。 3.3.5突变体测序 一般情况下，特别是获得明确的阳性或阴性结果时，不要求对突变体DNA测序。当发现个体差异 较大时，可进行DNA测序。测序通过识别特定组织特有的突变比率用于排除累积或克隆的可能性。 可能需要测序25个突变体。当发现突变率有少量增加时（即正好超过未处理对照数值），也可以考虑突 变体测序。如需测序，试验设计应该关注每个样本用于突变体测序的数量，根据所用的统计模型获得充 分的意义。 3 SN/T 5159—2019 3.4试验步骤 3.4.1动物数量和性别 每组最少由5只动物组成。如果无显著统计学差异，应增加动物数量。通常应该使用雄性动物。 只使用雌性动物的情况应给出合适的理由，如当测试人的女性专用药物时，或当调查妇科新陈代谢时。 如果从毒性和新陈代谢方面来说.在性别间有重大区别时，雌雄动物都需要进行测试。 3.4.2给药期 由于突变数量随着每次给药逐渐增加，需要多次重复给药，即连续28天每天给药。这个时间对于 弱诱变剂能够累积足够的突变，以及为能够在生长缓慢的组织中检测到突变提供了足够的暴露时间。 在某些情况时，也可使用其他染毒方案，但需在试验方案中说明。给药时间应该长于所有相关的代谢活 化酶的完全诱导时间，较短的给药时间有必要设置多次取样时间，这种方法更适合于生长率不同的组 织。某些情况下，可以使用所有已知的信息（如对于全身毒性或代谢和药物动力学）来说明试验方案的 合理性，尤其在偏离以上标准方法时。处理时间超过8周时，可以提高敏感性，也应该给出明确的解释 3.4.3剂量水平 剂量水平应该根据暴露途径相同的一般毒性的试验结果确定，或根据已知亚急性毒性试验结果确 定剂量范围。可以用同种非转基因啮齿类动物来确定剂量范围。在正式试验中，除了使用限度试验，应 有剂量-反应关系。应该包括阴性对照组和至少3个间隔适当的剂量组。最高剂量应该为最大耐药剂 量（MTD）。对于在低于无毒剂量下有特殊生物活性的物质（如激素类或分裂素），显示毒代动力学特性 已达饱和状态的物质，剂量设计时可以不按照上述标准，而应该具体情况具体分析。剂量水平应该覆盖 从最高毒性到微量毒性或无毒性的范围。 3.4.4限度试验 性，或者根据结构类似物的数据预期供试物无遗传毒性时，可以不必进行3个剂量的完整试验。对于给 药28d的试验（即28d给药，限定剂量是每天1000mg/kg体重）。对于给药期为14d或不足14d的 试验，限定剂量为每天2000mg/k