ICS 67.050 SN C 53 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T49602017 出口蜂蜜中耐高温 α-淀粉酶的测定 分光光度法 Determination of thermostable α -amylase in export honey- Spectrophotometriemethod 2017-11-07发布 2018-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 SN/T4960—2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：费晓庆、柳菌、陆慧媛、高玲、姜珊、李静静、吴斌、张睿、沈崇钰、 陈惠兰、赵增运。 S SN/T4960—2017 出口蜂蜜中耐高温α-淀粉酶的测定 分光光度法 1范围 本标准规定了出口蜂蜜中耐高温α-淀粉酶活性测定的分光光度法。 本标准适用于蜂蜜淀粉类糖浆的掺假鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3方法提要 蜂蜜用乙酸-乙酸钠缓冲溶液溶解后， ，在70℃水浴下加热处理30min，使得蜂蜜自身α-淀粉 酶失去活性，仅含有耐高温α-淀粉酶。 该溶液中加入淀粉溶液，部分淀粉被耐高温α-淀粉酶酶解，剩余的淀粉与碘反应产生监紫色。 随着酶解反应的进行，其产生的蓝紫色逐渐消失。 。采用分光光度计于660nm波长处测定其吸光度达 到0.235需要的时间。换算出1g蜂蜜在1h内酶解1%淀粉所需要的毫升数，即为蜂蜜中耐高温α- 淀粉酶活性。 4试剂和材料 除非另有规定，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1氯化钠。 4.2碘。 4.3 碘化钾。 4.4 乙酸钠。 4.5乙酸。 4.6可溶性淀粉。 4.70.5mol/L氯化钠溶液：称取14.5g（精确至0.01g）氯化钠（4.1），用煮沸后冷却的水定容至 500mL，有效期为1个月。 4.8碘储备液：称取8.8g（精确至0.01g）碘（4.2）和22g（精确至0.01g）碘化钾（4.3），用水定 容至1000mL，避光保存，有效期为6个月。 4.9碘工作溶液：称取20g（精确至0.01g）碘化钾（4.3）于盛有适量水的500mL容量瓶中，加入 5mL碘储备液（4.8），用水定容，混匀，每天现配。 4.10 ）1.59mol/L乙酸钠缓冲液（pH5.3）：称取53.2g（精确至0.01g）乙酸钠（4.4）于400mL水中， 1 SN/T4960—2017 加入10.5mL乙酸（4.5），用乙酸调节至pH5.3，用水定容至500mL，有效期为1个月。 4.11可溶性淀粉溶液：称取2.000g（精确至0.1mg）可溶性淀粉（4.6）于250mL的三角烧瓶中， 加入90mL水，一边振荡烧瓶一边急速加热至沸腾，并保持3min在沸腾状态。将溶液移人100mL 容量瓶中，用流水急速冷却至室温，用水定容并混匀。每天现配。 5仪器和设备 5.1紫外可见分光光度计。 5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g各一台。 5.3涡旋混匀器。 5.4pHI计。 5.5恒温水浴振荡器。 5.650mL、100mL、500mL、1 1000mL容量瓶。 6试样的制备与保存 未结晶的蜂蜜样品将其用力搅拌均匀，有结晶析出的样品或者固体样品可将瓶盖塞紧后，置于 40℃的水浴中温热，等样品全部融化后搅匀，冷却至室温。在融化时应注意防止水分挥发。 试样于室温下保存。 7测定步骤 7.1样品前处理 精确称取10g（精确至0.01g）试样于50mL烧杯中，加人50mL1.59mol/L乙酸钠缓冲液（4.10） 和20mL水，搅拌混合，使样品完全溶解，然后移入事先加有3.0mL0.5mol/L氯化钠溶液（4.7）的 50mL容量瓶中，并用水定容至刻度。 将样品置于70℃恒温水浴振荡器（5.5）中30min后冷却至室温，此样品用于蜂蜜中耐高温α- 淀粉酶的测定。 7.2 淀粉溶液的标定 取5.0mL可溶性淀粉溶液（4.11）于温度为40℃的10.0mL水中，充分混合。取1.0mL此溶液 于50.0mL试管中，加人10.0mL碘工作溶液（4.9），加人适量水后充分混合。用紫外可见分光光度 计（5.1）于660nm波长下用1cm比色皿，以水为空白对照测定吸光度，调整加水体积，使得吸光 度值在0.740~0.780范围内，记录加水的体积V（mL）。 7.3测定 准确吸取7.1中制备的样品10.0mL于50.0mL试管中，置于40℃水浴中15min后，加入50ml 温度为40℃的可溶性淀粉溶液（4.11），混合均匀并开始计时。 一定时问问隔下（最初为5min后），分别从反应容器中取出1.0mL的反应溶液，加入事先盛有 10.0mL碘工作溶液（4.9）和VmL水的50.0mL试管中，混匀。立即于660nm波长下用1cm比色Ⅲ， 以水为空白对照测定吸光度，直至吸光度低于0.235。每次测得吸光度与最终达到0.235所需时间关 系参见附录A中表A.1。 2 SN/T4960—2017 8 结果计算 以吸光度为纵坐标，时间（min）为横坐标，将所测的吸光度与其相对应的时间在对数坐标纸上 标出，作出一条直线，在这一直线查出样品溶液的吸光度达到0.235所需时间，某典型样品的吸光度 与酶解反应时间线性关系参见附录B，结果按照式（1）计算： .....(1) t 式中： 一蜂蜜中耐高温α-淀粉酶活性，单位为毫升每克小时[mL/（g·h）]； X 一吸光度达到0.235所需时间，单位为分钟（min）。 计算结果表示到小数点后一位。 回收率 9 样品添加回收率参见附录C。 3 SN/T4960—2017 附录A （资料性附录） 吸光度与终点值的相对应时间间隔 表 A.1 吸光度与终点值的相对应时间间隔表 吸光度值 终点时间/min 0.70 > 25 s9°0 20~25 0.60 15~18 ss'0 11~13 0s0 9~10 0.45 7~8 S 4