ICS 67.050 SN C 53 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4959—2017 出口蜂蜜中 -淀粉酶的测定 液相色谱法 Determination of- --amylase in export honey - 2017-11-07发布 2018-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 以正式出版文本为准 SN/T4959—2017 本标准按照GB/T1.1一2009和GB/T20001.4给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：陆慧媛、费晓庆、张晓燕、陈雷、姜珊、李静静、吴斌、张睿、沈崇钰、 丁涛、陈惠兰、赵增运。 以正式出版文本为准 SN/T4959—2017 出口蜂蜜中-淀粉酶的测定 液相色谱法 1范围 本标准规定了出口蜂蜜中-淀粉酶的液相色谱－紫外检测方法。 本标准适用于出口蜂密中-淀粉酶的测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3方法提要 蜂蜜样品用乙酸钠缓冲溶液溶解后，加人底物对硝基苯基- β-D-麦芽三糖进行酶解反应，-淀 粉酶将底物酶解为酶解产物对硝基苯-β-D-葡萄糖，采用液相色谱-紫外检测器测定，利用酶解产物 质量与-淀粉酶的线性关系，外标法定量。 4试剂和材料 除非另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1 乙：HPLC级。 4.2 乙酸钠。 4.3 乙酸。 对硝基苯-β-D-麦芽三糖：纯度≥99%， CAS号56846-39-0。 4.4 4.5 -淀粉酶标准品：70U/mg，纯度≥99%。 4.60.1mol/L乙酸钠缓冲液（pH值4.50）：称取乙酸钠（4.2）8.2g，加适量水溶解，用乙酸（4.3） 调pH值为4.50，最后定容至1000mL。 4.71.0mg/mL-淀粉酶标准储备溶液：准确称取适量的淀粉酶标准品（4.5），用水溶液配成 1.0mg/mL的标准储备液。储备液贮存在0℃~4℃冰箱中。 4.80.01mg/mL-淀粉酶标准中间溶液：用水将淀粉酶标准储备溶液（4.7）稀释成浓度为 0.01mg/mL标准中间溶液，储备液贮存在0℃~4℃冰箱中。 4.95.0mg/mL对硝基苯-β-D-麦芽三糖反应溶液：准确称取适量对硝基苯-β-D-麦芽三糖（4.4）， 用水溶解配成5.0mg/mL的反应溶液，于-18℃冰箱中保存。 4.10滤膜：0.45μm，水相。 5仪器 5.1液相色谱仪：配有二极管矩阵检测器。 1 SN/T4959—2017 5.2分析天平：感量为0.1mg和0.01g各一台。 5.3涡旋混匀器。 5.4 pH计。 5.5恒温水浴振荡器。 5.6具塞塑料离心管：50mL。 试样的制备与保存 6 未结晶的样品将其用力搅拌均匀，有结晶析出的样品可将瓶盖塞紧后，置于40℃的水浴中温热， 等样品全部融化后搅勾，迅速冷却至室温。在融化时应注意防止水分挥发。 试样于室温下保存。 7测定步骤 7.1提取 冲液（4.6）溶解并定容到5mL。 本 7.2酶解 于上述样品溶液中加人0.1mL对硝基苯-β-D-麦芽三糖反应溶液（4.9），摇匀后放人55℃恒温 水浴振荡器（5.5）中反应90min，反应结束后将上述溶液吸出，过水系0.45μm的滤膜（4.10），待 进样检测。 7.3标准工作溶液的配制 取5个干净具塞塑料离心管（5.6），分别加人2.8μL、5.5μL、14.5μL、28.5μL、57μL和145μL的 0.01mg/mL-淀粉酶标准中间溶液（4.8），然后用0.1mol/L乙酸钠缓冲液（4.6）定容至5mL，各标 准工作溶液的浓度分别对应于1U/kg、2U/kg、5U/kg、10U/kg、20U/kg和50U/kg。按照步骤7.2进 行处理。 7.4测定 7.4.1液相色谱-紫外检测条件 液相色谱-紫外检测条件如下： 色谱柱：Cl色谱柱，5μm，150mm×4.6mmi.d或相当者； a） b) 流动相：乙腈一水（15+85，V/V）； c） 流速：1.0mL/min; d）柱温：室温； e）进样量：10μL； f) 紫外检测波长：310nm。 7.4.2液相色谱-紫外测定 按照7.4.1的色谱条件测定样品溶液和标准工作溶液，以酶解产物对硝基苯-β-D-葡萄糖峰面积 为纵坐标，-淀粉酶标准工作溶液的浓度（U/kg）为横坐标，绘制标准工作曲线，用外标法测定样 品中的-淀粉酶含量。 2 SN/T4959—2017 样品中待测物响应应在标准曲线范围之内，如果超出标准曲线范围，应用0.1mol/L乙酸钠缓冲 液（4.6）进行适当稀释。上述色谱条件下，对硝基苯基-β-D-麦芽三糖和对硝基苯-β-D-葡萄糖的 保留时间分别为3.51min和4.02min。 -淀粉酶标准溶液的色谱图参见附录A图A.1。阴性样品色谱图参见附录B图B.1，阳性样品色 谱图参见附录C图C.1。 结果计算 8 用数据处理软件中的外标法，或绘制标准曲线，按式（1）计算蜂蜜样品中-淀粉酶的含量： :(1) m · 10-3 式中： 样品中-淀粉酶的含量，单位为活性单位每千克（U/kg）； X 由标准曲线而得的样品中-淀粉酶的含量，单位为毫克每毫升（mg/mL）； V 样品最终定容体积，单位为毫升（mL）； Uo- 一-淀粉酶标准品的活性，70，单位为活性单位每毫克（U/mg）； 样品质量，单位为克（g） u 定量低限和回收率 9.1 测定低限 本方法中蜂蜜中-淀粉酶的定量低限为1U/kg。 9.2 回收率范围 样品添加回收率参见附录D。 3