ICS 67.050 SN X 04 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4958—2017 出口蜂蜜中 4- 甲基咪唑和2- 甲基咪唑 的测定方法 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of 4-methylimidazole and 2-methylimidazole in honey for export -LC- MS/MS Method 以正式 2017-11-07发布 2018-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 以正式出版文本为准 SN/T4958—2017 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：刘芸、刘艳、陈磊、姜珊、张睿、吴斌、沈崇钰、丁涛、陈惠兰、赵增运。 S 以正式出版文本为准 SN/T4958—2017 出口蜂蜜中4一甲基咪唑和2-甲基咪唑的测定方法 液相色谱一质谱/质谱法 1范围 本标准规定了出口蜂蜜中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的液相色谱－质谱/质谱法测定方法。 本标准适用于出口蜂蜜中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的测定。 2规范性文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方 3方法提要 蜂蜜样品由水溶解，经滤纸过滤掉其中的杂质，清液过MCX小柱净化后用液相色谱-质谱/质谱 法测定，外标法定量。 4试剂和材料 除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为CB/T6682规定的一级水。 4.1 甲醇：色谱纯。 4.2 乙腈：色谱纯。 4.3 甲酸：色谱纯。 4.4 乙酸铵：CH,CO,NH4，色谱纯。 4.5 氨水：色谱纯。 4.6 乙水溶液（1+1，V/V）：准确量取500mL乙睛（4.2），加人500mL水，混合均匀。 4.7 甲酸溶液（2%，V/V）：准确量取2mL甲酸（4.3），加入100mL容量瓶中，用水定容至刻度，混合均匀。 4.85mmol/L乙酸铵溶液：准确称取0.39g乙酸铵（4.4），用水溶解并转移至1000mL容量瓶中，用 水定容至刻度，混合均匀。 4.9氨化甲醇溶液（5%，V/V）：准确量取5mL甲醇（4.1），加人100mL容量瓶中，用甲醇（4.1） 定容至刻度，混合均匀。 4.104-甲基咪唑标准品（4-Methylimidazole，C.H.Nz，CAS号：822-36-6）纯度大于等于99% 4.112-甲基咪唑标准品（2-Methylimidazole，C,H.N2，CAS号：693-98-1）纯度大于等于99%。 4.12标准储备液：分别准确称取适量的4-甲基咪唑、2-甲基咪唑标准品，用乙睛（4.2）配制成浓 度为1.0mg/mL的标准储备溶液，于0℃~4℃保存 4.13混合标准中间溶液：分别准确移取一定体积的4-甲基咪唑、2-甲基咪唑标准储备液（4.12）， 用乙腈（4.2）稀释为1.0μg/mL，于0℃~4℃保存 1 SN/T4958—2017 4.14混合标准工作液：准确移取一定体积的混合标准中间溶液（4.13），用水稀释成10ng/mL，现用现配。 4.15 MCX小柱：60mg，5mL，或相当者。 4.16 微孔滤膜：水相，0.45μm；有机相，0.45μm。 5 仪器和设备 5.1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)。 分析天平：感量分别为0.01g和0.01mg。 5.22 5.3高速离心机：8000r/min。 5.4超声振荡器。 5.5涡旋混合器。 5.6氮吹仪。 5.7具塞塑料离心管：50mL。 5.8 SPE固相萃取装置。 6试样制备和保存 6 为准 未结晶的蜂蜜样品将其用力搅拌均匀，有结晶析出的样品可将瓶盖塞紧后，置于40℃的水浴中 温热，等样品全部融化后搅匀，冷却至室温。在融化时应注意防止水分挥发， 试样于室温下保存，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 7分析步骤 7.1样品处理 7.1.1提取 式出版 称取1g试样（精确到0.01g）置于100mL容量瓶中，加人约30mL水在涡旋混合器（5.5）上混合 3min，使样品完全溶解，定容至刻度，混合均匀，然后，准确移取1mL以供净化用。 7.1.2净化 将MCX小柱预先用5mL甲醇（4.1）、5mL水活化，将样液以1滴/s~2滴/s的流速全部通过MCX 小柱（4.15）.流完后，先后分别加入3mL甲酸溶液（4.7）和3mL甲醇（4.1），以1~2滴/s的流速淋 洗小柱，弃去流出液。在65kPa的负压下，减压抽干约3min，最后用3mL5%的氨化甲醇溶液（4.9） 以1滴/s的流速洗脱于10mL试管中。该洗脱液于45℃下氮气吹干，用乙睛水溶液（4.6）1.0mL溶 解残渣，充分涡旋混合后过0.45μm滤膜（4.16），供液相色谱-质谱仪测定。 7.2测定 7.2.1 液相色谱条件 液相色谱条件如下： 色谱柱：AgilentHILICPlus柱（2.1mm×100mm，3.5μm）或相当者； a)1 b）流动相：5mmol/L乙酸铵溶液（4.8）和乙腈（4.2）（20:80，V/V）等洗脱； c） 流速：0.50mL/min； 进样量：10μL； F(P e）柱温：20℃。 2 SN/T4958—2017 7.2.2质谱条件 质谱条件如下： a）离子化模式：电喷雾正离子模式(ESI+)； b）质谱扫描方式：多反应监测(MRM）； c）其他参考质谱条件参见附录A中的表A.1。 7.2.3定性测定 在上述色谱-质谱条件下，如果样品中检测的色谱峰保留时间与相应的标准品相差在±2.5%以 内，并且在扣除背景后所选择的两对离子对与相当浓度标准溶液的相对丰度一致，其相对丰度允许偏 差不超过表1的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。 表1 定性确证时相对离子丰度的最大允许误差 相对离子丰度/% >50 >20至50 >10至20 ≤10 允许的相对误差/% ± 25 ± 30 ± 50 ± 20 7.2.4定量测定 按照上述液相色谱-质谱条件测定样品和标准工作溶液， 用标准曲线法测定样液中的4-甲基咪 唑和2-甲基咪唑的含量。样品中被测物质含量应在标准曲线范围之内，如果含量超出标准曲线范围， 应适当稀释至标准曲线范围内进行检测。标准溶液的提取离子流色谱图参见附录B图B.1。 7.3空白试验 除不称取试样外，均按上述步骤进行 8结果计算和表述 采用外标法定量，用色谱数据处理机或按式（1）计算样品中待测物残留量。计算结果应扣除空白值。 L n.A·m (1） 式中： X 试样中待测物残留量，单位为微克每克 （μg/g); A 样液中待测物的峰面积； c 标准工作溶液中待测物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V 样液最终定容体积，单位为毫升（mL）； n 稀释倍数，10； 标准工作溶液中待测物的峰面积； A. 最终样液代表的试样量，单位为克（g）。 m 测定低限和回收率 9.1测定低限 本方法的测定低限为1μg/g。 3