ICS 65.020.30 SN B 41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4923—2017 进出口食用动物中β-内酰胺类药物残留量 的测定 液相色谱-质谱／质谱法 Determination of beta-lactam antibiotic residues in foodstuffs of animal for import and exportLC-MS/MS method 以正式 2017-11-07发布 2018-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 以正式出版文本为准 SN/T4923—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国锦州出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人：肖珊珊、李一尘、代弟、董伟峰、徐静、孙兴权、苏明明、凯、姚佳 闫超杰。 S 以正式出版文本为准 SN/T4923—2017 进出口食用动物中β-内酰胺类药物残留量 的测定 液相色谱-质谱/质谱法 1范围 本标准规定了进出口食用动物的血清和尿液中10种β-内酰胺类药物残留量的液相色谱-质谱/ 质谱测定方法。 本标准适用于禽类和畜类动物血清，畜类动物尿液中阿莫西林、甲氧苯青霉素、乙氧萘青霉素、 苯唑青霉素、邻氯青霉素、 苯氧乙基青霉素、头孢匹林、头孢噻呋、头孢唑啉、头孢氨芋共10种β， 内酰胺类抗生素残留量的测定和确定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 试样中残留的β-内酰胺类药物经乙-水溶液（3+1， 体积比）提取，HLB固相萃取柱净化， 经水淋洗，乙睛-水溶液 发（1+1，体积比）洗脱，定容后供液相色谱-质谱／质谱法测定，外标法 定量。 4试剂与材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1乙腈：高效液相色谱纯 4.2 乙酸：高效液相色谱纯。 4.3磷酸氢二钠。 4.4 氢氧化钠。 4.5 5mol/L氢氧化钠溶液：100g氢氧化钠溶解于450mL水中，加水定容至500mL。 4.6 0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液：10g磷酸氢二钠溶解于450mL水中，用氢氧化钠溶液调节至pH8， 加水定容至500mL，使用前配制。 4.7乙睛-水溶液（3+1，体积比）：300mL乙睛与100mL水混合。 4.8乙腈-水溶液（1+1，体积比）：100mL乙腈与100mL水混合。 4.9阿莫西林等10种标准物质：纯度均≥98%。详细标准物质信息参见附录A。 4.10标准储备溶液的配制：分别称取适量的标准物质，用乙睛-水溶液（4.8）配制成100μg/mL的 标准储备溶液。标准储备液在1℃~4℃冰箱避光保存，有效期为1个月 4.11混合标准溶液的配制：取适量标准储备溶液（4.10）至100mL容量瓶中，用乙-水溶液（4.8） 定容至刻度，配制成混合标准溶液，各组分浓度均为1μg/mL。混合标准溶液在1℃~4℃冰箱避光保 1 SN/T4923—2017 存，有效期为5d。 4.12空白基质提取液：选取不含待测物的样品，按照7.1和7.2步骤操作，得到空白基质提取液。 4.13基质标准工作溶液的配制：根据需要，吸取一定量的混合标准溶液（4.11），用空白基质提取 液稀释至所需浓度，临用现配。 4.14HLB固相萃取柱或相当者：500mg，6mL。使用前依次用3mL甲醇、3mL水和3mL0.1mol/L 磷酸盐缓冲溶液（4.6）活化。 4.15滤膜：0.22μm，水相。 5仪器和设备 5 5.1高效液相色谱串联二级质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。 5.2电子天平：感量分别为0.01g，0.0001g。 5.3离心机。 5.4涡旋混合器。 5.5旋转蒸发仪。 5.6固相萃取装置。 5.7 pH计。 6 试样的制备与保存 6.1试样制备 版文本为准 将采集到的血液样本（≥8mL）置于未加抗凝剂处理的试管中，于室温下避光静止过夜，离心， 上层清液即为血清，转移血清至洁净容器内作为试样，加封并标明标记。尿液样品（≥5mL）装 人洁净容器内加封并标明标记。在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的 变化。 6.2试样保存 血清和尿液样品于-18℃以下保存。 7测定步骤 7.1提取 称取约2g（精确至0.01g）于50mL具塞离心管中，加入20mL乙睛-水溶液（4.7）高速振荡 提取2min后，4000r/min离心5min，移取上清液过滤至鸡心瓶中。再用10mL乙腈-水溶液（4.7） 重复提取一次，合并上清液于同一鸡心瓶中。 7.2净化 将提取液于45℃下旋转蒸发至约7mL左右，加人2mL0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液（4.6），混匀 后转移到已活化的HLB固相萃取柱（4.14）上，再用2mL0.1mol/L磷酸盐缓冲液（4.6）洗涤鸡心 瓶两次，洗液一并转移到柱上，控制流速小于1mL/min。用3mL水淋洗并抽干萃取柱，用4mL乙 睛-水溶液（4.8）洗脱并收集于10mL带刻度的玻璃管中（控制流速小于1mL/min）。用水定容至 4.0mL，涡旋混合后，过0.22μm滤膜供HPLC-MS/MS分析。 2 SN/T4923—2017 7.3测定 7.3.1 液相色谱条件 液相色谱条件如下： a） 色谱柱：Cl8，250mm×2.1mm（内径），粒度5μm，或相当者； b） 色谱柱温度：30℃； c) 流动相：梯度洗脱条件见表1； (P 流速：0.3mL/min； 进样量：20μL。 e 梯度洗脱条件 步骤 时间 /min 乙腈/% 0.1%甲酸水溶液/% 1 0.00 90 2 3.00 10 90 3 3.01 45 55 4 10.00 90 10 5 10.01 10 90 6 12.00 06 7.3.2 2质谱条件 质谱条件如下： a）离子化模式：电喷雾正离子模式（ESI+）； b）扫描方式：多反应监测（MRM）； c）雾化气、气帘气、 辅助气 碰撞气均为高纯氮 使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求， 喷雾电压等电压值应优化至最佳灵敏度，参 考质谱条件参见附录B。 7.3.3定性标准 每组被测组分选择1个母离子，2个以上子离子 ，在相同实验条件下，样品中待测组分的保留时 间，与混合基质标准校准溶液中的对应的保留时间偏差在±2.5%以内；且样品谱图中各组分监测离 子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的监测离子的相对丰度进行比较，偏差 不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。 表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度/% >50 0S~0z< >10~20 ≤10 允许的相对偏差/% ± 20 ± 25 ± 30 ± 50 7.3.4定量测定 根据试样中被测试物的含量情况，选取响应值相近的基质标准工作溶液一起进行色谱分析，基 质标准工作溶液和样液中β-内酰胺类药物的响应值均应在仪器线性范围内。对基质标准工作溶液和 样液等体积参差进行测定。在上述色谱条件下10种β-内酰胺类药物的参考保留时间参见附录B。β- 3