ICS 65. 020. 30 SN B 41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4920—2017 猪丹毒检疫技术规范 Quarantineprotocolforswineerysipelas 2017-11-07发布 2018-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 SN/T4920—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草， 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检变局、中华人民共和国江西出人境检验检 疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国重庆出入境检验检疫局 本标准主要起草人：张强、杨春华、林颖静、花群义、李树清、熊炜、王艳、王昱、王巧 全、李健。 1 SN/T4920—2017 猪丹毒检疫技术规范 1范围 本标准规定了猪红斑丹毒丝菌的分离鉴定、SYBRGreenI荧光PCR试验和猪丹毒血清培养凝集 试验的技术规范 本标准适用于猪丹毒的诊斯及流行病学调查 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件。其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GR/T6682 2分析实验室用水规格和分析方法 下列缩略语适用于本文件。 ER：红斑丹毒丝菌（erysipethrix thusiopathiae) TSA：胰陈大豆琼脂（trypitesoyagar） TSB：胰陈大豆肉汤（tryptiesoybroth） PCR：聚合酶链式反应（polymerase chainreaction） 4 临床症状 见附录A。 5 病原分离鉴定 5.1 生物安全 猪红案丹毒丝菌是人畜共患病原菌，样品的处理、细菌学检查应在生物安全二级实验室操作： 废弃物的处理应符合生物安全的管理规定。 5.2样品采集 无菌采集发病猪的耳静脉血和切开疹块挤压出的血液或渗出液。死亡病例、急性病例可采集被检 猪的心血、肝、脾、肾、游巴结等胜器；亚急性疹块病例可采集皮肤疹块病料；慢性病例可采集关节 液和心内膜的增生物。采集样品如不能及时处理，可放置4℃C冰箱冷藏。 5.3细菌学检查 制成的血涂片或脏器组织抹片，用革兰氏染色，镜检。红斑丹毒丝菌是一种纤细的革兰氏阳性小 杆菌，菌体平直或稍弯。在血涂片上，可见到散在于红细胞之间的菌体，有的出现丛集，还能见到被 1 SN/T4920—2017 白细胞吞赚的现象。在脏器的抹片中，菌体常单独、成对或丛状排列。在膜增生的显微组织和关节 液涂片中，见到的红斑丹毒丝菌呈长丝状，构成丝状菌团。 5.4分离培养 将病料接种于pH值7.4~7.8含有5%健康马血清的马丁肉汤培养液（见B.1）马丁琼脂培养基（见 B.2）或TSB培养液（见B.3）、TSA血琼脂培养基（见B.4），在37C恒温箱中填养24h-48h。红斑 丹毒丝菌在波体培养基中生长，使培养液变混浊，在4°C冰箱中放置2d-3d后，在管底部有乳白色 沉淀，轻轻将试管报动，沉淀物似絮状悬浮于液体中，有丝绸光泽。在马丁琼脂培养基上形成直径约 为0.8mm-1.0mm的透明露淘状的小菌落，继续培养室4d以后，少数首落发生变异，菌落边缘呈 现不规则状。在TSA血琼脂培养基上培养48h可形成直径均为1mm-2mm边缘整齐的首落，稍带蓝 色光泽，初代分离的菌落出现轻度的α溶血。 5.5生化试验 取经过血琼脂培养基中37℃纯化培养48h的菌落进行生化鉴定（见表1） 表1红斑丹毒丝菌的生化鉴定表 果 乳 海 松 t山 甘 VP 本 19 明 浴 牛 新 萄 乳 三 藻 梨 试 生 三 牵 露 杨 化 噪 血 奶 糖 糖 糖 糖 格 糖 糖 糖 糖 醇 醇 醇 油 糖 试 穿 型 培 试 验 刺 养 素 验 基 产 产 产 试 抵 a 酸不声 酸不产 酸不产 酸 管 固 不产 产服 抗 气 气 气 生 长 5.6血清型鉴定 5.6.1试剂和器材 5.6.1.1抗原制备 将可疑菌落接种到100mL含5%健康马血清的马丁肉汤中，37℃培养36h，0.5%甲醛溶液灭 活24h，用0.5%PBS溶液洗涤离心（8000r/min，15min）2次，在沉淀物中加3mL兼流水，经115C 高压15min，离心（8000r/min，15min），上清液为被检抗原。 5.6.1.2 2标准阳性血清 标准阳性血清一般为猪丹毒丝菌型特异性兔抗血清，由指定单位提供。 5.6.1.3 3标准阳性抗原 由指定单位提供。 2 SN/T4920—2017 5.6.1.4打孔器 孔内径3mm，可定制梅花形打孔器。 5.6.2 琼脂扩散试验 5.6.2.1 用pH值7.2的PBS配制1.2%琼脂凝胶，加热融化后，在玻璃平Ⅲ中铺制成3mm厚的胶 板，凝胶凝固后打六角梅花形孔，孔径3mm，孔间距离4mm，小心挑出孔内琼脂，注意勿破坏周围 琼脂。打完孔后在酒精灯火焰上加热封底。 5.6.2.2中央孔加入50μ标准阳性血清 5.6.2.3周围孔分别加人50μL标准阳性抗原、被检抗原和PBS对照。 5.6.2.4 加样完毕后静置10min，然后放入37℃带盖湿盒中反应，24h观察结果，48h判定结果， 72h终判。阳性血清与相对应的标准阳性抗原应出现沉淀线，与PBS不出现沉淀线，则试验成立。 被检抗原与阳性血清孔之间出现沉淀线为阳性，无沉淀线为阴性。 5.7 SYBRGreenI荧光PCR试验 5.7.1 试剂 试验用水应符合GB/T6682要求。 5.7.1.1 SYBRPCR预混液，或其他具有等同效果的商品化试剂； 5.7.1.2 TSB培养基： 5.7.1.3 DEPC水，可选购商品化试剂 5.7.2 设备 5.7.2.1 二级生物安全柜。 5.7.2.2 高压灭菌锅。 5.7.2.3 微量移液器。 5.7.2.4 高速冷冻离心机。 5.7.2.5 荧光PCR仪。 5.7.3 引物 猪丹毒丝菌属特异性引物，扩增片段大小为202bp，序列为： ERI6S-F : 5-AGTCTTGGAGAAATTCAG-3* ERI6S-R : 5-TCCGCCATAACTATTACA-3' 猪红斑丹毒丝菌特异性引物，扩增片段大小为119bp，序列为： ER1-F : 5-GCAGATCGAGGGTAAGTACA-3* ER2-R : 5-TAACTACAACAGTGCGTAAG-3' 引物纯度为HPLC级，用DEPC水溶解至10μumol/L后，保存于-20C各用。 5.7.4 质控物质 使用猪红丹毒丝菌（E.rhuscaiopathiae，ATCC19414，血清2型）作为阳性对照菌株，扁桃体 丹毒丝菌（E.fonsillarm，ATCC4339）作为阴性对照菌株，活菌经灭活后作为对照；用DEPC水作 为空白对照。 3 SN/T4920—2017 5.7.5样品的准备 5.7.5.1将受测细菌单个菌落接种到5mLTBS培养液内，液体样本或无菌研磨组织样本可直接按种 5mLTSB选择性培养液（见B.5），37℃培养箱培养48h；同时制备阳性对照和阴性对照菌株菌液； 5.7.5.2无菌取1.5mL培养物到灭菌的离心管内；12000r/min离心3min，弃去上消，加入1.5mL DEPC水重悬沉淀；12000r/min高心3min，弃去上清，再次加入1.5mLDEPC水重悬沉淀。 5.7.6核酸的提取 将上述菌重忌液在沸水中煮15min，10000r/min离心3min沉淀菌体醇片，上清内即含有细菌基 因组DNA，将上清转移到干净的离心管内-20℃保存各用。 或将菌液直接离心，离心后弃去上清液，按细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取模板 DNA，然后将其溶于5OμLTE中。 5.7.7扩增反应体系配制 每个PCR反应管内加人10μLSYBR荧光PCR反应预混液，4条引物各加1μL，再加人制备好的 DNA溶液6μL，补充DEPC水至反应总体积25μL，充分混合均匀。盖紧管盖后，500r/min离心30s： 5.7.8荧光PCR反应 将5.7.7中配制好的扩增体系放人荧光PCR仪内，记录样品摆放顺序，选定SYBR程序。设置如 下反应参数： 第一阶段，预变性95°C/30s； 第二阶段，变性95℃C/15$，退火58℃/17$，延伸72°C/20s，40个循环，荧光收集设置在 58℃退火阶段进行； 第三阶段，溶解曲线分析程序，95℃0s，65℃15s，95℃0s，前两步温度升降速度20/s 最后一步温度升降速率0.1°C/s。或使用仪器软作默认分析程序 5.7.9 结果判定 5.7.9.1 质控标准 如阳性对照、阴性对照和空白对照不满足以下条件，此次实验视为无效： 阳性对照出现两条溶解曲线，溶解温度在85.60℃±0.80℃和75.67℃±0.79℃； 阴性对照出现单一溶解曲线，溶解温度在85.60℃±0.80℃； 空白对照无扩增曲线。 5.7.9.2 结果描述及判定 扩增产物中同时出现两条溶解曲线，且溶解温度为85.60℃±0.80℃和75.67℃±0.79°C，表明 样本中存在猪红斑丹毒丝菌 扩增产物出现单一溶解曲线，且溶解温度为85.60℃±0.80℃，表明样本中存在丹毒丝菌属成 员，面非猪红斑丹毒丝菌。 扩增产物未出现溶解曲线或非上述两种情况曲线，表明样本中不存在丹毒丝菌， SN/T4920—2017 6 血清学试验（猪丹毒血清培养凝集试验）1) 6.1 材料 6.1.1 培养基：马丁肉汤 6.1.2 菌种：猪红斑丹毒丝菌血清2型强毒菌种。 6.2 操作步骤