ICS65.020.30 SN B 41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4918—2017 鼠痘检疫技术规范 Quarantine protocol for ectromelia 2017-11-07发布 2018-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 SN/T4918 3—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、南通大学、中华人民共和国江西出 人境检验检疫局、中华人民共和国河南出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：仇保丰、宋鸿雁、杨春华、徐超、童明龙、陈峰、杨娜、孙思扬、顾蓓蓓 刘文斌、顾炳泉。 SN/T4918—2017 鼠痘检疫技术规范 1范围 本标准规定了鼠痘的病毒分离、PCR和荧光PCR检测方法。 本标准适用于鼠痘的临床诊断、流行病学调查及检疫监测。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 3临床诊断 3.1临床症状 临床症状根据毒株、小鼠品系和机体状况的不同，可呈现急性、亚急性、慢性或隐性等型。急性 型多见于初次发生本病的鼠群，病鼠被毛粗乱无光泽，食欲减退乃至废绝，常于4h~12h内死亡。亚 急性型（皮肤型）病鼠的口鼻及脸部肿胀、破溃，四肢及尾部肿胀，出现红疹或痘疹，并有浆液性渗 出物，尤以脚掌为甚；随后患处结痴，有的形成坏疽；1d~2d坏疽部位脱落，病鼠不愿行走或拖地 而行；一般在数天内死亡，有的恢复。慢性型或隐性型病鼠由上两种病型鼠迁延转化而来，多见于本 病流行后期，偶尔有皮肤型病鼠出现；育成鼠生长发育缓慢，生产率下降。 3.2病理变化 病理变化主要表现为：急性型病鼠体表淋巴潮红肿大，脾肿大，可见坏死灶。肝灰褐色或灰黄 色，有出血点。十二指肠水肿，肠管充血。幼鼠可见肾和膀胱出血，有的胸腹水和心包液增多。亚急 性型病鼠头、尾及四肢水肿，皮下有浆液性渗出物及坏死性溃疡灶。肝肿大，呈紫色、土黄色或土灰 色，有灰白色坏死灶。脾肿大，呈暗紫色，表面可见大量白色小斑点。慢性型病鼠以肝肿大和脾肿大 为特征。组织学检查可在许多脏器的上皮细胞浆内见到大量嗜酸性包涵体 根据特征性临床症状和病理变化可以作出初步诊断。进一步确诊应采集样品进行实验室检测 4 病毒分离与鉴定 4.1器材 4.1.1生物安全柜。 4.1.2二氧化碳培养箱。 4.1.3鸡胚孵化器。 4.1.4倒置显微镜。 4.1.5冷冻高速离心机。 1 SN/T4918—2017 4.1.6培养基过滤除菌系统。 4.1.7匀浆器或研磨器。 4.1.8细胞培养瓶、细胞培养板等。 4.1.9照蛋灯、开孔器。 4.1.10可调微量移液器。 4.1.11灭菌手术剪、镊子。 4.2试剂和材料 4.2.1试剂：PBS、双抗溶液、细胞培养液、细胞维持液和细胞分散液配方及配制方法见附录A。实 验室用水符合CB/T6682中一级水要求。 （Vero），另外还可选用人营颈癌Hela细胞、幼仓鼠肾细胞、人羊膜细胞、鼠胚细胞、鸡胚成纤维细 胞等。9日龄~11日龄SPF鸡胚。细胞及鸡胚由指定单位提供， 4.2.3毒株：鼠痘病毒标准株（ATCCVR-1374），由指定单位提供 4.3样品的采集与处理 4.3.1样品的采集与运输 采样按CB/T18088进行。主要无菌采集病鼠的抗凝全血、水疱液、脓疱液、皮疹上盖、痴皮、 病变肢端和肝、脾、肾等脏器的病变组织。样品密封保存于4℃或置于冷藏盒中快速送达实验室。 4.3.2样品制备 将2.0g以上组织样品放人高压灭菌处理过的匀浆器中反复研磨，加入pH7.2、0.01mol/L的PBS 溶液制成20%（质量浓度）组织悬液，混合均匀后置于-20℃冰箱中快速反复冻融3次，4℃、5000r/min 离心15min，取上清加人1%双抗溶液作用3h~4h，作无菌检查后备用。 4.4病毒分离方法 4.4.1鸡胚分离法 取4.3.2制备的组织匀浆上清液接种9日龄~11日龄SPF鸡胚绒毛尿囊膜，每份样品接种3只鸡 胚，每只鸡胚接种0.2mL，同时用PBS和鼠痘病毒标准株分别接种鸡胚作为阴、阳性对照。将鸡胚 置36.5℃孵育，每天检查1次，弃去24h内死亡的鸡胚，72h~96h收获鸡胚置4℃冰箱过夜，观察 鸡胚绒毛尿囊膜有无散在分布、直径约1mm的白色痘斑出现。当阴性和阳性对照成立，接种样品的 鸡胚绒毛尿囊膜出现典型痘斑，立即无菌取出尿囊膜，用勾浆器反复研磨，加人pH7.2、0.01mol/L 的PBS溶液制成20%（质量浓度）组织悬液，混合均匀后置于-20℃冰箱中快速反复冻融3次，4℃、 5000r/min离心15min，取上清进行进一步鉴定。如果鸡胚绒毛尿囊膜上未出现痘斑，继续按上述方 法接种鸡胚盲传3代。盲传过程中若出现痘斑，按上述原则制备和收集鸡胚尿囊膜匀浆液上清备用； 若盲传后仍未出现痘斑，则判为鼠痘病毒阴性。 4.4.2细胞培养法 当MA104细胞或Vero细胞长成单层时，弃去细胞培养液，用不含血清的细胞培养液冲洗细胞单 层2次，接种经过处理的组织样品上清（以能淹没细胞单层为宜），每份样品至少接种2孔，于37℃ 吸附1h，倾去多余液体，用细胞维持液冲洗细胞单层2次，按常规方法加人细胞培养液培养4d。同 时设立正常细胞与接种鼠痘病毒标准株的细胞作为阴性和阳性对照。 每天在倒置显微镜下观察细胞病变（CPE）并做好相应记录。如果正常细胞无变化，而接种痘病 2 SN/T4918—2017 毒标准株的细胞出现圆缩、脱落和多核巨细胞等细胞病变现象时，表明设立的阴性和阳性对照成立。 若接种样品的细胞也出现与阳性对照一致的典型细胞病变时，观察细胞病变达到85%以上时收集细 胞，置于-20℃冰箱中快速反复冻融3次，4℃、5000r/min离心15min，取上清进行进一步鉴定。 如果4d内未出现细胞病变，则按上述方法盲传6代。盲传过程中若出现典型细胞病变，按上述原则 制备和收集细胞上清备用；若盲传后仍未出现CPE，则判为鼠痘病毒阴性。 4.4.3培养物的鉴定 收获的培养物应进行鉴定，鉴定可使用PCR或荧光PCR等方法。 5聚合酶链反应（PCR） 5 5.1仪器 5.1.1 生物安全柜。 5.1.2J PCR热循环仪。 5.1.37 凝胶电泳仪。 5.1.4凝胶成像系统。 5.1.5冷冻高速离心机。 5.1.6 可调微量移液器。 5.2试剂 5.2.1 细胞裂解液：见A.6。 5.2.2TaqDNA聚合酶：5U/μL。 5.2.3100bpDNAladderMarker（脱氧核糖核酸分子量标准）。 5.2.410倍浓度TaqDNA聚合酶缓冲液。 5.2.5MgClz:25mmol/L. 5.2.6dNTP混合物：脱氧腺苷三磷酸（dATP）、脱氧胸苷三磷酸（dTTP）、脱氧鸟苷三磷酸（dGTP） 脱氧胞苷三磷酸（dCTP）各2.5mmol/L。 5.2.7引物（ECTV-F：5'-AATACAAGGAGGATCT-3';ECTV-R:5*-CTTAACTTTTTCTTTCTC-3') 5.2.850×TAE电泳缓冲液：见A.7。 5.2.96×加样缓冲液：见A.8 5.2.10 溴化乙锭溶液：见A.9。或使用其他等效的核酸染料。 5.2.11 电泳级琼脂糖粉。 5.2.12 2人工合成鼠痘病毒目的核酸片段：参见附录B。 5.3 3模板DNA制备 取4.3.2或4.4制备的上清液，或者取水疱液、脓疱液及抗凝全血200μL，加入1.5mL离心管内 再加人400μL细胞裂解液，反复颠倒混勾；加入600μL的酚／三氯甲烷混合液（体积比为25：24）混 匀，4℃、12000r/min离心10min；取上清重新加人600μL的三氯甲烷混勾，4℃、12000r/min离心 10min；取上清加人0.8倍的异丙醇混匀后静置15min，4℃、12000r/min离心10min；弃去上清液 加入70%乙醇600μL洗涤沉淀，4℃、12000r/min离心10min，室温晾干后加人30μL~40μLTE缓冲 液溶解沉淀，备用。或者用市售等效DNA提取试剂盒进行提取。 3